噻唑烷化合物YFZ-22對A549細胞的作用機制研究.pdf

1、研究背景和研究目的：
　　肺癌是嚴重危害人類健康的一類疾病，具有較高的發(fā)病率與死亡率，已經(jīng)成為癌癥致死的首要原因。目前肺癌的治療主要以化療為主，但是現(xiàn)有的肺癌治療的藥物往往毒副作用較大且易引起耐藥，因此，尋找高效、毒副作用較小又能有效地克服多藥耐藥的化療藥物對于肺癌的治療具有極其重要的意義。
　　近年來，隨著對噻唑烷化合物的研究發(fā)現(xiàn)其具有廣譜的生物活性，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、化學(xué)、醫(yī)藥、生物學(xué)等諸多領(lǐng)域，能誘導(dǎo)多種腫瘤細胞的分化與

2、凋亡，在癌癥治療方面顯示出良好的應(yīng)用前景。如MMPT和DBPT能通過影響細胞周期以及誘導(dǎo)肺腺癌細胞的凋亡途徑來抑制腫瘤細胞的生長。鑒于噻唑烷化合物在肺腺癌中表現(xiàn)出的抗腫瘤活性以及在非小細胞肺癌中的潛在應(yīng)用，選擇YFZ-22（一種新型的噻唑烷化合物）作為研究藥物，將其引入A549細胞中進行抗腫瘤活性的檢測以及作用機制的初步研究，以期為肺癌的治療提供理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　1．體內(nèi)抑瘤檢測：建立裸鼠肺癌的移植瘤模型，給藥

3、后觀察YF Z-22對體內(nèi)腫瘤生長的抑制作用。
　　2．分析YFZ-22對A549細胞體外生長的抑制作用：
　　― XTT法檢測細胞存活率；
　　―克隆形成實驗檢測細胞的克隆形成能力。
　　3．YFZ-22對A549細胞的凋亡誘導(dǎo)作用：
　　―倒置相差顯微鏡觀察細胞的形態(tài)；
　　―吉姆薩染色檢測細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化；
　　―Hoechst33258熒光染色，熒光顯微鏡下觀察細胞核的片段化；

4、>　　―Nucleosome ELISA試劑盒檢測細胞凋亡率。
　　4．細胞周期檢測：流式細胞術(shù)檢測YFZ-22對A549細胞周期的影響。
　　5．調(diào)控細胞周期運轉(zhuǎn)及凋亡的基因p53、p21表達檢測：ELISA法檢測p53、p21蛋白表達。
　　6．細胞內(nèi)ROS、GSH水平檢測：熒光分光光度計檢測細胞內(nèi)ROS、GSH水平。
　　7．細胞凋亡途徑檢測：
　　―Caspase酶活檢測試劑盒分析Caspase的酶

5、活變化；
　　― ELISA法檢測Caspase酶抑制劑對YFZ-22誘導(dǎo)的細胞凋亡的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1．YFZ-22對體內(nèi)A549細胞增殖的影響表明：YFZ-22能顯著的抑制裸鼠皮下腫瘤的生長，且抑制A549細胞的增殖具有明顯的時間依賴性，隨著藥物作用時間延長，其抑制率逐漸增大。
　　2．YFZ-22對A549細胞體外生長的抑制作用：
　　―XTT實驗表明，YFZ-22可以顯著抑制體外培養(yǎng)的A

6、549細胞的生長，且隨著藥物濃度的增大，細胞存活率呈下降趨勢，即呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，并且對正常細胞毒性較?。?br>　　―克隆形成實驗表明，一定濃度的YFZ-22能夠顯著抑制A549細胞的克隆形成能力。
　　3．YFZ-22誘導(dǎo)A549細胞凋亡的檢測：
　　―3.0μM的YFZ-22處理A549細胞48小時，倒置相差顯微鏡，吉姆薩染色以及Hoec hst33258熒光染色可以觀察到細胞的形態(tài)學(xué)變化，細胞數(shù)量明顯減少，體積變

7、小，變圓，細胞膜出芽發(fā)泡，細胞內(nèi)空泡化現(xiàn)象嚴重，大多數(shù)細胞的細胞核固縮呈致密濃染，染色質(zhì)凝集且邊緣化，出現(xiàn)凋亡小體，處于凋亡的不同階段，呈現(xiàn)出凋亡的形態(tài)學(xué)特征；
　　―Nucleosome ELISA試劑盒檢測核小體水平顯示，用3.0μM和6.0μM的YFZ-22分別處理 A549細胞6 h、12 h、24 h、48 h，核小體水平顯著增加，表明YFZ-22能誘導(dǎo) A549細胞的凋亡，且具有明顯的時間和劑量依賴性。
　　4．

8、流式細胞術(shù)對細胞周期的檢測表明：用3.0μM的YFZ-22分別處理A549細胞6h、12h、24h后，引起A549細胞G2/M期阻滯。
　　5．P53、p21蛋白表達的檢測表明：YFZ-22上調(diào)了A549細胞內(nèi)p53、p21蛋白水平，且在一定時期內(nèi)具有時間依賴性。
　　6．細胞內(nèi) ROS、GSH水平檢測表明：與對照組相比，YFZ-22處理的A549細胞內(nèi) ROS水平有了顯著提高且具有劑量依賴性，GSH水平顯著降低，同樣具有劑

9、量依賴性。
　　7．YFZ-22誘導(dǎo)A549細胞的凋亡機制研究：Caspase酶活檢測以及Casp ase抑制劑對凋亡誘導(dǎo)的影響表明，YFZ-22能誘導(dǎo) A549細胞凋亡，其凋亡過程可能與線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1．YFZ-22能抑制體內(nèi)外A549細胞的增殖；
　　2．YFZ-22誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的A549細胞的凋亡；
　　3．YFZ-22影響A549細胞的細胞周期，引起G2/M期阻滯；