羅非魚源無(wú)乳鏈球菌特異性卵黃抗體的制備及其活性研究.pdf

1、全球水產(chǎn)業(yè)每年因無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae/group B Streptococcus，GBS)病的流行性暴發(fā)造成了慘重的經(jīng)濟(jì)損失，羅非魚是GBS的易感宿主之一，而近年來(lái)引起我國(guó)養(yǎng)殖羅非魚暴發(fā)該疾病的GBS又以Ⅰa型為主。人們通常使用抗生素對(duì)羅非魚GBS病進(jìn)行防治，隨著抗生素帶來(lái)的問(wèn)題日益嚴(yán)重，人們開始研制或者找尋更有效、更安全的新型藥物來(lái)替代抗生素。在尋找抗生素替代品的過(guò)程中，卵黃抗體(immunog

2、lobulin of eggyolk，IgY)由于生物學(xué)上不激活補(bǔ)體，不與Fc受體和人類風(fēng)濕因子結(jié)合，可與異源抗原上的更多表位發(fā)生反應(yīng)等高特異性優(yōu)勢(shì);以及制備上成本低、產(chǎn)出率高、提純簡(jiǎn)便快捷，并具有耐酸堿、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，引起了許多研究人員的興趣。
　　本研究以Ⅰa型菌株GBS/HN0303為抗原免疫蛋雞，采集免疫蛋;采用氯仿法與飽和硫酸銨鹽析法結(jié)合的方式制備特異性IgY。運(yùn)用玻片凝集試驗(yàn)、免疫印跡(WB)、細(xì)菌特異性染色、酶聯(lián)免

3、疫吸附試驗(yàn)(ELISA)與試管凝集試驗(yàn)等方法，從定性到定量，對(duì)所得IgY抗體特性、在蛋雞體內(nèi)免疫應(yīng)答情況及其理化性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè);并通過(guò)體外抑菌與體內(nèi)抗病試驗(yàn)對(duì)其抗菌效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　1.IgY制備效果及理化性質(zhì)
　　本研究以1×109CFU/mL菌液制成的全菌滅活疫苗，可引起蛋雞較好的免疫應(yīng)答，經(jīng)過(guò)四次免疫后，雞蛋中的IgY可以達(dá)到較高的濃度;經(jīng)間接ELISA測(cè)定，雞蛋中IgY抗體水平峰值出現(xiàn)于四免后第48d，可以達(dá)到1∶1

4、00000，并可維持至少一個(gè)月時(shí)間。通過(guò)玻片凝集、特異性染色及免疫印跡等試驗(yàn)，證明sp-IgY具有較高結(jié)合活性;另外在低溫環(huán)境下儲(chǔ)存IgY活性穩(wěn)定，且在pH3～7范圍內(nèi)，IgY抗體活性良好。
　　2.IgY的體外抑菌能力
　　在液體環(huán)境中，sp-IgY的抑菌效率明顯，28C下孵育，500μg/mL的sp-IgY可成功抑制等體積1×105CFU/mL的GBS/HN0303生長(zhǎng)達(dá)12h;在固體培養(yǎng)條件下，sp-IgY抑菌效果與其

5、特異性組分含量正相關(guān)，含量越高，抑菌效果越佳，呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系;還證明了sp-IgY在魚體內(nèi)對(duì)GBS/HN0303具有中和能力。
　　3.IgY的體內(nèi)抗病能力
　　以羅非魚為模型動(dòng)物，檢驗(yàn)了所制備IgY的防治功效?？傮w上，都表現(xiàn)出了對(duì)羅非魚免疫增強(qiáng)的作用，具體體現(xiàn)為攻毒后延緩羅非魚發(fā)病進(jìn)程，其中sp-IgY組較對(duì)照組有效降低了累計(jì)死亡率，表現(xiàn)出了其具有特異性抗病能力;而將sp-IgY拌料口服免疫時(shí)，隨著飼料中sp-IgY