供者細胞脾內移植誘導小鼠氣管移植耐受.pdf

1、肺移植是治療終末期肺病唯一有效的方法，但目前面臨困境，免疫抑制效果尚顯不足，免疫治療相關并發(fā)癥已十分嚴重，移植物排斥和免疫治療相關疾病嚴重影響了肺移植受者的長期生存。繼續(xù)加強非特異性免疫抑制可能對改善總體結果無益。 誘導移植耐受，即供者特異性免疫耐受，是目前最有希望的解困之道。存骨髓移植(BMT)和供者特異性輸注(DST)這兩個耐受現(xiàn)象的啟發(fā)下，含BMT方案和含DST逐漸發(fā)展成為移植耐受研究領域的兩類經典誘導方案。2008年一個

2、令人振奮的腎移植臨床試驗報告稱，在5例受者中有4例經含BMT方案成功誘導出移植耐受。然而，輻照副反應和/或移植物抗宿主反應(GVHR)風險仍是含BMT方案、含DST方案應用于臨床器官移植的重大阻礙，尤其是對于那些終末期肺病患者。在過去十年，隨著共刺激阻滯藥物和新型免疫抑制劑的出現(xiàn)，非特異性免疫抑制被進一步加強，但誘導供者特異性耐受的研究進展不大。 模仿其他耐受現(xiàn)象可能是研究供者特異性耐受誘導的另外一個突破口。除了BMT、DST相

3、關耐受外，另外還有兩個已知的耐受現(xiàn)象，也就是自發(fā)肝移植耐受和多器官移植的免疫特惠現(xiàn)象。已經明確，在嚙齒類動物模型中，肝、脾或胸腺的異體移植物可為同期或后續(xù)的同一供者來源的其他器官移植物提供免疫保護。由于操作復雜、創(chuàng)傷大，把聯(lián)合多器官移植開發(fā)成為像含BMT方案或含DST方案那樣的耐受誘導方案幾乎是不可能的。 移植領域近期一個新進展是，肝細胞移植可取代實體肝移植治療某些急性肝衰竭。在小鼠模型，肝細胞移植是通過脾內注射供者肝臟細胞來完

4、成的。除了肝臟，脾臟和胸腺都可制成單個細胞懸液。因此，用細胞移植取代脾、胸腺實體器官移植也是有可能的。 本研究擬通過細胞移植來復制肝、脾和胸腺實體器官移植對小鼠異位氣管移植物的免疫保護作用。 第一部分：脾內細胞移植取代臟器移植誘導小鼠氣管移植物耐受的可行性研究 目的：研究脾內細胞移植取代臟器移植誘導小鼠氣管移植物耐受的可行性 材料與方法：供者為6～8周齡健康雄性BALB/c(H-2d)小鼠，受者為6～8周

5、齡健康雌性C578L/6(H-2b)小鼠。所有受者術前1d接受60Coγ射線全身輻照(TBI：5.5Gy)，手術當天接受氣管異位移植和細胞移植。除了對照組(Con)外，200μl的5×106骨髓細胞經尾靜脈注入。5.5B、5.5BS、5.5BT、5.5BH組受者分別接受脾內注射PBS(100μl)、脾細胞(1×107/100μl)、胸腺細胞(1×107/100μl)、或者肝臟細胞(1×107/100μl)。在術后1、3、5、7周流式細胞

6、儀檢測外周血單核細胞的混合嵌合。監(jiān)測GVHR，直到受者死亡或者8周的觀察期到期。所有死于GVHR的受者做尸檢。組織學檢查氣管移植物、脾、肝和肺。 結果：在5.5BS、5.5BT組的受者檢測到供者巨嵌合(＞1％)，第1周末時分別為54.3±13.1％和47.6±3：17.1％，但到7周末時很快降到9.9±7.0％和5.8±7.6％。這兩組受者在7周之后出現(xiàn)嚴重的GVHR，死亡率高達50％和60％。5.5B、5.5BH、Con組未出

7、現(xiàn)嵌合，沒有GVHR，也沒有死亡。7周時氣管管腔在5.5B、5.5BH、Con組均已完全閉塞，而在5.5BS、5.5BT組閉塞25％。 結論：脾內細胞移植可以取代脾、胸腺的實體臟器移植，誘導小鼠異位氣管移植模型的移植耐受。這種移植后初期形成的免疫穩(wěn)態(tài)很脆弱，在沒有免疫抑制保護下迅速瓦解。脾內肝細胞移植技術上可行，但不能發(fā)揮類似于實體肝移植物的免疫侏護作用。 第二部分：脾內注射與其他細胞移植途徑的比較研究 目的：確

8、定脾內、胸腺內、靜脈內細胞移植三種途徑中哪一種最佳。 材料與方法：供者為6～8周齡健康雄性BALB/c(H-2d)小鼠，受者為6～8周齡健康雌性C57BL/6(H-2b)小鼠。所有受者術前1d接受60Coγ射線全身輻照(TBI：5.5 Gy)，手術當天接受氣管異位移植和細胞移植。除了對照組(Con)外，200μl的5×106骨髓細胞經尾靜脈注入。5.5BT和5.5BBs組受者分別接受脾內注射胸腺細胞(1×107/100μl)、未

9、分類的骨髓細胞(1×107/100μl)。5.5BTt組受者接受胸腺內注射胸腺細胞(每葉一半，總計1×107/100μl)。5.5BB組受者接受額外劑量(1×107/100μl)的尾靜脈內骨髓移植。在術后1、3、5、7周流式細胞儀檢測外周血單核細胞的混合嵌合。監(jiān)測GVHR，直到受者死亡或者8周的觀察期到期。所有死于GVHR的受者做尸檢。組織學檢查氣管移植物、脾、肝和肺。 結果：在5.5BT、5.5BTt和5.5BBs組的受者檢測

10、到供者巨嵌合(＞1％)，第1周末時分別為47.6±17.1％、40.1±8.3％和33.2±11.5％，但到7周末時很快降到5.8±7.6％、0.06±0.03和0.08±0.02％。5.5BT組受者在7周之后出現(xiàn)嚴重的GVHR，死亡率高達60％。5.5BB和Con組未出現(xiàn)嵌合，沒有GVHR，也沒有死亡。7周時氣管管腔在5.5BTt和5.5BBs幾乎閉鎖、在5.5BB和Con組完全閉塞，而在5.5BT組閉塞僅25％。 結論：在免

11、疫保護方面，供者細胞脾內移植優(yōu)于胸腺內移植和外周靜脈移植。移植細胞的免疫反應性越大、免疫調節(jié)作用越好，脾內細胞移植是利用供者免疫反應性細胞誘導耐受的最佳途徑。 第三部分：脾內細胞移植的免疫特惠強度 目的：明確脾內細胞移植的免疫特惠強度。 材料與方法：供者為6～8周齡健康雄性BALB/c(H-2d)小鼠，受者為6～8周齡健康雌性C57BL/6(H-2b)小鼠。所有受者術前1d接受60Coγ射線全身輻照(TBI：3.

12、0Gy)，手術當天接受氣管異位移植和細胞移植。除了對照組(Con)外，200μl的5×106骨髓細胞經尾靜脈注入。3.0B、3.0BS、3.0BT、3.0BST、3.0BSTB和3.0BSTBL組受者分別接受脾內注射PBS(100μl)、脾細胞(1×107/100μl)、胸腺細胞(1×107/100μl)、脾+胸腺細胞(總計1×107/100μl)、脾+胸腺+骨髓細胞(總計1×107//100μl)、脾+胸腺+骨髓+外周血單核細胞(總計

13、1×107/100μl)。在術后1、3、5、7周流式細胞儀檢測外周血單核細胞的混合嵌合。監(jiān)測GVHR，直到受者死亡或者8周的觀察期到期。所有死于GVHR的受者做尸檢。組織學檢查氣管移植物、脾、肝和肺。 結果：所有實驗組的受者在第1、3、5、7周末時均未檢測到外周血供者巨嵌合，沒有GVHR，也沒有死亡。7周時氣管管腔在所有實驗組均完全閉塞。 結論：當TBI從5.5Gy降到3.0 Gy，BMt(5×106/只)和脾內細胞移植