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文檔簡介
1、長鰭吻鮈(Rhinogobio ventralis Sauvage et Dabry)主要分布于金沙江、岷江、雅礱江、沱江、烏江下游、嘉陵江中下游以及長江上游干流等流域,是一種習(xí)慣于在急流險灘、亂世交錯的江河底層等黑暗水環(huán)境活動的底棲小型魚類,屬典型的流水性種類。長鰭吻鮈又俗稱土耗兒,為我國長江上游特有物種,屬于“長江上游珍稀特有魚類國際級保護(hù)區(qū)”保護(hù)名錄中66種特有魚類之一。近些年來,長江上游各大型梯級水利工程的相繼建設(shè),人類過度捕撈
2、與開發(fā)利用,長鰭吻鮈種群自然資源量呈急劇下降趨勢。從物種價值及其受威脅程度評估發(fā)現(xiàn),長鰭吻鮈已達(dá)3級急切保護(hù)狀,被列為低危魚類。對此,國內(nèi)多家增值放流站已將長鰭吻鮈列為增值放流對象,對長鰭吻鮈馴化養(yǎng)殖與人工繁殖技術(shù)等方面的研究日益受到重視。本文以長鰭吻鮈為主要研究對象,通過篩選出的多態(tài)微衛(wèi)星位點構(gòu)建了長鰭吻鮈微衛(wèi)星熒光多重PCR體系,并將其用于長鰭吻鮈野生親本種群的遺傳特性分析,同時建立了基于微衛(wèi)星熒光多重PCR的長鰭吻鮈親子鑒定技術(shù),
3、旨在為長鰭吻鮈人工繁殖、家系管理以及增值放流效果評估等工作提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。其主要研究結(jié)果如下:
?。?)長鰭吻鮈微衛(wèi)星熒光多重PCR技術(shù)的建立與優(yōu)化
從NCBI基因文庫中獲取了長鰭吻鮈70個微衛(wèi)星序列,并根據(jù)已報道的相應(yīng)微衛(wèi)星位點選取33個多態(tài)性相對較高的位點合成引物,在12個野生長鰭吻鮈個體中進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳以及銀染法檢測后,挑選出多態(tài)性較高、擴(kuò)增效果最好的15個微衛(wèi)星位點用以開
4、發(fā)多重PCR體系。通過對退火溫度以及對反應(yīng)體系中可能影響多重PCR擴(kuò)增效果的因素分別進(jìn)行了優(yōu)化,本實驗最終建立了5組微衛(wèi)星熒光多重PCR(組合A、B、C、D和E),每組含有3個微衛(wèi)星位點。
?。?)基于微衛(wèi)星標(biāo)記對長鰭吻鮈瀘州野生親本種群遺傳多樣性的評估
利用長鰭吻鮈15個多態(tài)位點及其所構(gòu)建的微衛(wèi)星熒光多重PCR技術(shù),對長江上游瀘州江段采集的40尾長鰭吻鮈野生親本群體進(jìn)行遺傳多樣性評估以及遺傳結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果共檢測到等位
5、基因數(shù)為234個,平均等位基因數(shù)為15.600,單個位點等位基因數(shù)為5(REN02)―23(REN17、RVE-13);多態(tài)信息含量為0.729―0.940,平均多態(tài)信息含量為0.872;期望雜合度為0.77825―0.95506,平均期望雜合度為0.89600;觀測雜合度為0.55263―0.97500,平均觀測雜合度為0.82691,表明種群遺傳多樣性處于較高水平。近交系數(shù)為-0.06283―0.29267,平均值為0.07961(
6、P=0.00000±0.00000)。微衛(wèi)星位點之間未出現(xiàn)顯著的連鎖不平衡現(xiàn)象。除位點REN16、RV-8、REN34、RVE-13和REN02外,其他位點均顯著偏離哈迪-溫伯格平衡(P<0.05)。利用Structure軟件聚類分析表明該長鰭吻鮈種群未出現(xiàn)遺傳分化。瓶頸效應(yīng)檢測結(jié)果表明該長鰭吻鮈種群個體數(shù)量有所下降,近期經(jīng)歷了嚴(yán)重的瓶頸效應(yīng)。
?。?)基于微衛(wèi)星熒光多重 PCR的長鰭吻鮈親子鑒定技術(shù)的建立及子一代遺傳特征評估<
7、br> 利用長鰭吻鮈15個多態(tài)位點及其所構(gòu)建的微衛(wèi)星熒光多重PCR體系,建立了鰭吻鮈親子鑒定技術(shù)。結(jié)果顯示,無論親本基因型是否已知,其累積排除概率均大于99.99%;當(dāng)僅使用多重PCR組合A、B和C時,在雙親基因型未知和單親基因型已知的情況下,其累積排除概率分別為99.83%和99.99%,因此可以認(rèn)定親本和子代之間存在親子關(guān)系。研究結(jié)果表明15個多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記所構(gòu)建的長鰭吻鮈微衛(wèi)星熒光多重PCR親子鑒定技術(shù)是可靠的。對長鰭吻鮈人工繁
8、殖子一代群體遺傳多樣性評估結(jié)果顯示,共檢測到的等位基因數(shù)為98個,平均等位基因數(shù)為6.533,單個位點等位基因數(shù)為4―10;多態(tài)信息含量為0.579―0.879,平均多態(tài)信息含量為0.730;期望雜合度為0.606―0.894,平均期望雜合度為0.766;觀測雜合度為0.458―1.000,平均觀測雜合度為0.808。表明長鰭吻鮈F1子代群體的遺傳多樣性較高。F1子代群體總近交系數(shù)(FIT)為0.01469,單個群體內(nèi)近交系數(shù)(FIS)
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