基于微衛(wèi)星的黃喉擬水龜親子鑒定技術(shù)的建立及應(yīng)用.pdf

1、黃喉擬水龜（Mauremysmutica）是一種集食用、藥用、觀賞于一身的高值淡水龜類。由于經(jīng)濟(jì)開發(fā)造成生境破壞以及人為過(guò)度捕撈等因素的影響，黃喉擬水龜野生種群數(shù)量急劇下降，已被國(guó)家列為瀕危物種。近年黃喉擬水龜?shù)氖袌?chǎng)需求量越來(lái)越大，催生了黃喉擬水龜?shù)娜斯ゐB(yǎng)殖，并且養(yǎng)殖規(guī)模越來(lái)越大，已成為龜類養(yǎng)殖的熱門種類之一。由于黃喉擬水龜性成熟時(shí)間較長(zhǎng)，需要5年左右，產(chǎn)卵較少，一只母龜平均獲苗3-4個(gè)，導(dǎo)致苗種供應(yīng)嚴(yán)重不足，制約了養(yǎng)殖規(guī)模的進(jìn)一步發(fā)展

2、。因此，如何提高黃喉擬水龜?shù)姆敝沉κ丘B(yǎng)殖行業(yè)目前急需解決的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)室近幾年致力于提高黃喉擬水龜繁殖力的研究，而高繁殖力黃喉擬水龜品系選育是其中的一個(gè)研究方向。母龜繁殖力的高低需要由其后代數(shù)量來(lái)確定，而由大群體自由交配產(chǎn)生的后代其系譜難以確定，導(dǎo)致后續(xù)工作難以開展。因此，我們開發(fā)了基于微衛(wèi)星的黃喉擬水龜親子鑒定技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)以132只同齡的黃喉擬水龜父母本，及其在2013、2014兩年產(chǎn)的子代為實(shí)驗(yàn)材料，利用開發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建多重PC

3、R體系，進(jìn)行遺傳多樣性和母龜與子代間的親緣關(guān)系鑒定研究，根據(jù)鑒定結(jié)果確定繁殖力較高的黃喉擬水龜母龜個(gè)體，為高繁殖力親本選育奠定基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容包括以下三方面：
　　1.黃喉擬水龜微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)與篩選
　　根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室所測(cè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的微衛(wèi)星序列設(shè)計(jì)44對(duì)微衛(wèi)星引物，另外引用發(fā)表文獻(xiàn)中的6對(duì)微衛(wèi)星引物，共合成50對(duì)微衛(wèi)星引物，對(duì)黃喉擬水龜親本基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共有34對(duì)引物的PCR產(chǎn)物條帶清晰，且特異性較好。用包

4、含30個(gè)個(gè)體的黃喉擬水龜親本隨機(jī)群體檢測(cè)該34對(duì)微衛(wèi)星引物多態(tài)性，其中6對(duì)引物在該隨機(jī)群體中只有1個(gè)等位基因，其他28對(duì)引物的等位基因數(shù)均在4個(gè)及以上。該28個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)共檢測(cè)到284個(gè)等位基因，單個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)（Na）介于4-21之間，平均等位基因數(shù)10.1；多態(tài)信息含量（PIC）介于0.337-0.922之間，平均值為0.717，其中22個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)PIC>0.5，表現(xiàn)為高度多態(tài)性，另外6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)PIC>0.25表現(xiàn)為中度多態(tài)

5、性；觀測(cè)雜合度（Ho）介于0.333-0.967之間，平均值為0.678；期望雜合度（He）介于0.396-0.942之間，平均值為0.754。無(wú)效等位基因頻率均介于-13.63-43.31％之間。
　　2.微衛(wèi)星多重PCR體系的建立及其遺傳多樣性分析
　　選用其中16對(duì)引物用于建立多重PCR，通過(guò)選擇引物組合，以及優(yōu)化引物濃度比例、退火溫度、循環(huán)數(shù)、熒光接頭濃度等反應(yīng)參數(shù)，成功構(gòu)建了兩個(gè)均含8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多重PCR體系。

6、體系1包含的位點(diǎn)為：sg8、 mmu13、 mmu1、mmu7、 mmu2、 sg10、 mmu3、 mmu4，其混合比例為5：8：8：10：2：6：2：11；反應(yīng)退火溫度為57.5℃，循環(huán)次數(shù)為22；熒光接頭濃度為2μmol/L。體系2包含的位點(diǎn)為sg3、sg16、sg11、sg29、sg22、sg5、sg23、sg27，其混合比例為：10：10：4：5：5：7：15：10；反應(yīng)退火溫度為62.5.5℃，循環(huán)次數(shù)為20；熒光接頭濃度為

7、1.2μmol/L。采用多重PCR體系和遺傳分析儀ABI3130獲得了親本和子代群體在16個(gè)微衛(wèi)星座位上的基因型數(shù)據(jù)。根據(jù)基因型數(shù)據(jù)分析了132只黃喉擬水龜親龜與598只子龜?shù)倪z傳多樣性，結(jié)果表明親本與子代群體在16個(gè)微衛(wèi)星座位上均具有較高的基因變異程度，遺傳多樣性較豐富，且子代遺傳多樣性與較為豐富的一方親本更為接近。
　　3.黃喉擬水龜親子鑒定及其在高繁殖力親本選育中的應(yīng)用
　　依據(jù)89只母龜，以及2013年與2014年分

8、別產(chǎn)的296只與302只子龜?shù)幕蛐蛿?shù)據(jù)，先采用Cervus3.0軟件以2013年產(chǎn)的子代與候選母本組成的待檢群體為例，進(jìn)行在雙親基因型未知時(shí)親本排除率分析：16個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中單個(gè)位點(diǎn)的親本排除概率介于9.2％與74.7％之間，累積排除概率為99.99%。然后對(duì)2013、2014兩年產(chǎn)的子代與其母本群體進(jìn)行親緣關(guān)系鑒定，結(jié)果顯示：在95%的置信度標(biāo)準(zhǔn)下，模擬鑒定率均接近100%，實(shí)際鑒定率分別為87%和94%。
　　根據(jù)親子鑒定結(jié)

9、果，母龜在2013與2014兩年產(chǎn)下的子代數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果為：2013年可能有母龜沒有產(chǎn)下后代，而2014年至少有一個(gè)母本未產(chǎn)下后代；母本m2、m16、m17、m23、m27、m38、m43、m73、m117、m124在2013年與2014年的子代數(shù)均不低于5個(gè)，表現(xiàn)出較高的繁殖能力，這些母本及子代都是黃喉擬水龜高繁殖力品系的選育對(duì)象。
　　本實(shí)驗(yàn)中建立的微衛(wèi)星多重PCR為黃喉擬水龜親子鑒定提供了工具，而2013與2014兩年的親子鑒