文拉法辛對(duì)血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能及皮層神經(jīng)可塑性影響.pdf

1、背景：
　　血管性癡呆（Vascular Dementia,VaD）是由各種腦血管疾病引起的智能障礙綜合征，多繼發(fā)于腦動(dòng)脈粥樣硬化、腦卒中等，在老齡人群癡呆中的發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)。隨著人口老齡化和心血管疾病的高發(fā)，VaD的患病率在近十年內(nèi)將持續(xù)升高。VaD的發(fā)病機(jī)制與缺血性腦損傷所致的神經(jīng)元退行性變、神經(jīng)元凋亡和壞死等相關(guān)，然而更深入的細(xì)胞學(xué)和分子學(xué)機(jī)制尚不明確。臨床治療原則主

2、要是控制危險(xiǎn)因素，包括控制血壓、血糖、血脂、戒煙、抗血小板聚集藥物治療等預(yù)防腦卒中的發(fā)生，由于目前缺乏治療 VaD的特異性藥物，臨床研究證實(shí)AD有效的藥物雖然能在一定程度上緩解VaD癥狀，但治療效果不佳。
　　腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Brain-derived neurotrophic factor BDNF),是神經(jīng)生長因子家族中表達(dá)最為豐富的成員，不僅對(duì)神經(jīng)元正常功能的維持發(fā)揮作用，而且對(duì)神經(jīng)元損傷后的修復(fù)也發(fā)揮著重要的作用，如促

3、進(jìn)神經(jīng)元的存活、生長、分化和可塑性等。研究發(fā)現(xiàn)BDNF能調(diào)節(jié)GAP-43及突觸素的表達(dá)。Gap-43蛋白是一種膜相關(guān)磷蛋白，主要表達(dá)于發(fā)育或再生軸突的生長錐內(nèi)，因此可作為神經(jīng)再生的標(biāo)志【1】。突觸素是一種與突觸囊泡相連的磷酸蛋白，其為突觸的特異性標(biāo)記物之一，能反應(yīng)出突觸的含量及分布【2】。三者在神經(jīng)發(fā)育及可塑性中發(fā)揮著重要作用。文拉法辛是一種新型的抗抑郁藥，其主要藥理機(jī)制為抑制神經(jīng)突觸前膜對(duì)5-TH及去甲腎上腺素的再攝取【3】。值得一提

4、的是，已經(jīng)有研究顯示文拉法辛可提高抑郁患者腦內(nèi)BDNF蛋白的含量，從而改善患者的認(rèn)知功能。然而，通過使用鹽酸文拉法辛提高血管性癡呆患者腦內(nèi) BDNF蛋白的含量，從而促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)改善患者認(rèn)知功能還未有研究報(bào)道，因此探索鹽酸文拉法辛對(duì)血管性癡呆的療效及作用機(jī)制的研究具有重要意義。
　　目的：
　　本課題以大鼠永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷（BCCAo）建立血管性癡呆模型，觀察大鼠BCCAo術(shù)后認(rèn)知功能改變、神經(jīng)可塑性改變的發(fā)生機(jī)制，并觀

5、察抗抑郁藥物鹽酸文拉法辛對(duì)血管性癡呆大鼠腦組織 BDNF，GAP-43,突觸素表達(dá)的影響及其行為學(xué)作用，探討鹽酸文拉法辛對(duì)血管性癡呆大鼠大腦神經(jīng)可塑性和認(rèn)知功能影響以及其潛在作用機(jī)制。
　　方法：
　　1動(dòng)物分組及血管性癡呆動(dòng)物模型建立
　　1.1分組
　　180只wistar大鼠隨機(jī)分成六組，文拉法辛1組（Venlafaxine5mg/kg.dgroup，n=30），文拉法辛2組（Venlafaxine15mg

6、/kg.dgroup，n=30），文拉法辛3組（Venlafaxine20mg/kg.dgroup，n=30）,血管癡呆大鼠（VaD group,n=30),安慰劑組（VaD-Placebo group，n=30），假手術(shù)組（sham-operated group，SO group，n=30）。1.2建立大鼠血管性癡呆模型（Bilateral Common Carotid Arteries occlusion，BCCAo）
　　1

7、0％水合氯醛腹腔注射麻醉后，大鼠頸前正中行一縱形切口，鈍性分離皮下組織，肌肉暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)，鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)并用1號(hào)非吸收性絲線對(duì)頸總動(dòng)脈進(jìn)行雙重結(jié)扎，假手術(shù)組大鼠只分離頸總動(dòng)脈及迷走神經(jīng)但不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈。
　　1.3藥物干預(yù)
　　文拉法辛1組，文拉法辛2組，文拉法辛3組及安慰劑組大鼠在BCCAo術(shù)后24小時(shí)開始灌胃給藥，每日固定于上午9：00~10:00給藥。分別在1周，2周，3周，4周處死大

8、鼠。假手術(shù)組及血管癡呆組大鼠 BCCAo術(shù)后不給于任何藥物干預(yù)。
　　2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)行為學(xué)觀察
　　觀察血管癡呆大鼠及文拉法辛對(duì)BCCAo術(shù)后大鼠空間學(xué)習(xí)、記憶的干預(yù)作用。
　　假手術(shù)組，安慰劑組，血管癡呆組，文拉法辛1組，文拉法辛2組，文拉法辛3組用藥1周，2周，3周，4周后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，記錄定位航行試驗(yàn)中大鼠找到逃生平臺(tái)的平均逃避潛伏期（MeanEscape Latency Time,ME

9、LT）和空間探索試驗(yàn)中大鼠在目標(biāo)象限的平均搜尋時(shí)間（MeanTime In Target Quadrant，MTiTQ）以此評(píng)估大鼠的運(yùn)動(dòng)、空間學(xué)習(xí)、記憶能力。
　　3文拉法辛干預(yù)后大鼠海馬、皮層的神經(jīng)病理學(xué)觀察
　　3.1腦組織取材、石蠟包埋和制片
　　BCCAo術(shù)后第二天開始給予文拉法辛、安慰劑灌胃，分別在用藥1周，2周，3周，4周后從假手術(shù)組、血管癡呆組、安慰劑組和文拉法辛組中各取5只大鼠，水迷宮測(cè)試后進(jìn)行過度麻

10、醉后經(jīng)心臟灌注固定，斷頭取前腦及海馬區(qū)，自視交叉后3mm處冠狀位切取約3mm厚度腦組織，海馬包含在內(nèi)。梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋。
　　3.2神經(jīng)病理學(xué)染色
　　石蠟組織作冠狀位連續(xù)切片（2μm），蘇木素-伊紅染色后在光學(xué)顯微鏡高倍鏡（400×）下觀察。
　　4免疫組織化學(xué)檢測(cè)大鼠海馬CA1區(qū)、皮層神經(jīng)元BDNF，GAP-43,
　　突觸素蛋白的表達(dá)
　　觀察慢性腦缺血皮層區(qū)及海馬區(qū)CA1區(qū)神經(jīng)元BDN

11、F、GAP-43、突觸素蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及腦缺血后給予文拉法辛干預(yù)對(duì)大鼠海馬 CA1區(qū)、皮層神經(jīng)元BDNF、GAP-43、突觸素蛋白表達(dá)水平的影響。
　　石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化和高壓修復(fù)后，以EnVision酶免疫組化法檢測(cè)海馬CA1區(qū)、皮層神經(jīng)元BDNF、GAP-43、突觸素的表達(dá)。
　　5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　應(yīng)用上海欣軟信息科技有限公司開發(fā)的 SuperMaze動(dòng)物行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)分析Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)過程中采集

12、到的大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡；應(yīng)用ImagePro Plus圖文分析系統(tǒng)采集組織病理、免疫組化圖片及進(jìn)行免疫組化平均光密度分析。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗(yàn)和Levene方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（χ±s）表示；Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素重復(fù)測(cè)量的方差分析，首先對(duì)重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行球性檢驗(yàn)（Mauchly’s test of sphericity)。當(dāng)

13、資料不滿足Mauchly’s球?qū)ΨQ性檢驗(yàn)時(shí)采用Greenhouse-Geisser法校正自由度；其余正態(tài)分布資料方差齊性采用ANOVA，方差不齊采用Welch校正檢驗(yàn)，多重比較方差齊性采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果以P<0.05為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1 Morris水迷宮行為學(xué)分析結(jié)果
　　1.1在定位航行試驗(yàn)中血管性癡呆組、假手術(shù)組、文拉法辛1組，文拉法

14、辛2組，文拉法辛3組以及安慰劑組大鼠的平均游泳速度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），提示BCCAo誘導(dǎo)的血管性癡呆大鼠不存在明顯運(yùn)動(dòng)功能障礙。
　　1.2在定位航行試驗(yàn)中VaD大鼠1~4周的平均逃避潛伏期（MELT）較假手術(shù)組大鼠明顯延長（P<0.05），在空間探索試驗(yàn)中目標(biāo)象限的平均搜尋時(shí)間（MTiTQ）則較假手術(shù)組明顯縮短（P<0.001），提示VaD大鼠存在空間學(xué)習(xí)和記憶障礙。1.3在定位航行試驗(yàn)中文拉法辛1組及文拉法辛2組分別

15、在用藥3周和2周后VaD大鼠 MELT明顯縮短，與安慰劑組相比 p<0.05；在空間探索試驗(yàn)中，文拉法辛1及文拉法辛2組干預(yù)3周后其在目標(biāo)象限的平均搜索時(shí)間較安慰劑組顯著延長（P<0.05).提示文拉法辛5mg/kg.d及鹽酸文拉法辛15mg/kg.d干預(yù)3周后能明顯改善VaD大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶功能。
　　2海馬CA1區(qū)、皮層組織病理學(xué)觀察結(jié)果
　　在BCCAo術(shù)后1周、2周、3周和4周，血管性癡呆組大鼠皮層及海馬CA1區(qū)神

16、經(jīng)元變性、壞死隨缺血時(shí)間延長逐漸加重，VaD組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元計(jì)數(shù)進(jìn)行性減少（P<0.01）。
　　3海馬CA1區(qū)、皮層BDNF,GAP-43,突觸素免疫組化檢測(cè)結(jié)果
　　3.1免疫組化顯示海馬CA1區(qū)及皮層區(qū)神經(jīng)元胞漿及胞核內(nèi)BDNF蛋白在術(shù)后1周表達(dá)量出現(xiàn)短暫性的增高（圖3-3-3C1,圖3-3-3D1，P<0.05），術(shù)后3~4周表達(dá)量明顯減少（圖3-3-3C3、圖3-3-3C4，P<0.01；圖3-3-3D4，

17、P<0.05）。皮層區(qū)GAP-43及突觸素免疫組化顯示在術(shù)后1周均高于假手術(shù)組，但隨時(shí)間的延長表達(dá)量逐漸下降（圖3-3-4）。
　　3.2 BCCAo術(shù)后給予文拉法辛干預(yù)，文拉法辛處理組大鼠海馬、皮層神經(jīng)元BDNF蛋白在用藥后2~4周表達(dá)量均較安慰劑組增多（圖3-3-7F2~F4,P<0.01；圖3-3-8N2~N4，P<0.01)；皮層區(qū)GAP-43蛋白在用藥3周，4周后較安慰劑組表達(dá)量顯著增多（圖3-3-11H3,H4;P<0

18、.05)
　　結(jié)論：
　　1雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷術(shù)后1~4周，血管性癡呆大鼠在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出明顯空間學(xué)習(xí)和記憶缺損，該癥狀與海馬、皮層缺血性神經(jīng)損傷相伴隨，隨腦缺血時(shí)間延長進(jìn)行性加重。
　　2 BCCAo術(shù)后海馬、皮層BDNF、GAP-43、突觸素在腦缺血早期出現(xiàn)短暫性表達(dá)增高，可能為中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)缺血性腦損傷后代償性的神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)。
　　3 BCCAo術(shù)后早期給予文拉法辛3周及4周后，VaD大鼠

19、在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中的平均逃避潛伏期縮短，在目標(biāo)象限的平均搜索時(shí)間有所延長，提示5mg/kg.d及15mg/kg.d的鹽酸文拉法辛可改善大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶功能。
　　4 BCCAo術(shù)后早期給予文拉法辛干預(yù)2~4周后，皮層及海馬區(qū)BDNF表達(dá)均較安慰劑對(duì)照組增多；皮層區(qū)GAP-43的表達(dá)量較安慰劑組明顯增多，推測(cè)文拉法辛改善缺血性腦損傷后認(rèn)知障礙的機(jī)制可能與5-HT調(diào)整BDNF表達(dá)，兩者共同促進(jìn)神經(jīng)元存活，促進(jìn)神經(jīng)重塑有關(guān)。