氟西汀改善腦缺血引起的空間學習記憶缺陷及其機制研究.pdf

1、腦卒中(俗稱中風)為腦部血管阻塞或破裂引起腦部血流受阻所致病癥，是中老年人的常見病、多發(fā)病。流行病學調(diào)查顯示腦卒中存活者中有近30％的患者出現(xiàn)不同形式和程度的認知功能障礙，主要表現(xiàn)為記憶障礙、定向力障礙、空間結構能力障礙、推理思維能力障礙等。其中，記憶障礙者占45.4％?？臻g學習記憶障礙直接影響腦血管病的康復，已成為腦卒中研究的重點。 近年來，動物實驗和臨床研究均已經(jīng)證實成年哺乳動物神經(jīng)元再生對缺血后腦功能的重建至關重要?？臻g學

2、習記憶主要依賴于海馬，因此海馬齒狀回(dtentate gyrus，DG)的神經(jīng)元再生對于學習記憶至關重要。大量的文獻已經(jīng)證實局灶性腦缺血能夠激發(fā)成年哺乳動物側(cè)腦室室管膜下區(qū)(subventricular zone，SVz)以及海馬DG區(qū)神經(jīng)元再生，新生神經(jīng)元能向損傷的腦區(qū)遷移而且可以整合到已有的神經(jīng)回路中形成一定的突觸聯(lián)系，這有利于改善缺血引起的神經(jīng)功能缺陷及海馬依賴性的學習記憶能力。這些研究均提示缺血后空間認知損害可能通過增強海馬部

3、位的神經(jīng)元再生得到改善。 氟西汀被廣泛應用于抗抑郁的治療，其主要作用是抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸間隙的5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)再攝取。近年來的研究顯示，慢性的氟西汀治療在生理狀態(tài)下可以促進哺乳動物海馬新生細胞的增殖和存活，然而，在腦缺血后慢性氟西汀治療能否增強神經(jīng)元再生從而改善空間學習記憶功能?為了探討這一問題，我們研究了小鼠局灶，}生腦缺血后慢性氟西汀治療對海馬DG區(qū)神經(jīng)元再生及空間學習記憶缺陷

4、的影響，為中風后空間認知障礙提供了一個安全有效的治療方法。本文采用成年小鼠大腦中動脈阻塞(middlecerebral artery OCtlusion，MCAO)制備局灶性腦缺血再灌注模型，為研究腦缺血后學習記憶障礙提供一種較理想的實驗動物模型。 為了研究氟西汀對腦缺血后感覺運動功能及空間學習記憶能力的影響，實驗共分為3組：假手術組-給予生理鹽水；溶劑對照組-MCAO造模后給予生理鹽水；氟西汀組-MCAO造模后給予氟西汀，在M

5、CAO造模后第8天開始給予氟西汀(10 mg/kg，腹腔注射，每日一次)，連續(xù)給藥28天至MCAO造模后第35天結束，同時假手術組及溶劑對照組給予相同體積的生理鹽水。 在腦缺血造模后第7，14，21，28，35，42，49及59天分別進行神經(jīng)損傷嚴重程度評分(Neurological severity scores，NSS)和足失誤測試(foot fault tests，F(xiàn)FT)來評價感覺運動功能。實驗結果顯示：NsS實驗中，各

6、個測量時間點溶劑對照組小鼠神經(jīng)損傷嚴重程度評分顯著高于假手術組，說明局灶性腦缺血能顯著損害小鼠的感覺運動功能；但在氟西汀組和溶劑對照組之間神經(jīng)損傷嚴重程度評分沒有統(tǒng)計學差異，說明慢性氟西汀治療對腦缺血后感覺運動功能的恢復沒有影響。FFT實驗是對小鼠運動中左右兩側(cè)前肢放置的協(xié)調(diào)性進行評估，結果顯示各個時間點假手術組小鼠左右兩側(cè)前肢的失足率各約50％，氟西汀組及溶劑對照組小鼠缺血對側(cè)前肢失足比例均顯著增高，但這兩組之間沒有顯著性差異，這同樣

7、說明慢性氟西汀治療對腦缺血后運動協(xié)調(diào)功能的恢復沒有影響。 在MCAO造模后第22-28天、50-59天即氟西汀治療兩周、四周后分別進行Morris水迷宮實驗(Morris water maze，MWM)檢測氟西汀對空間學習記憶能力的影響。 在氟西汀治療兩周時，MWM隱蔽平臺試驗氟西汀組和溶劑對照組逃避潛伏期及游泳路線的長度均顯著長于假手術組；但氟西汀組和溶劑對照組之間沒有顯著性差異，同樣空間探索試驗中氟西汀組和溶劑對照組

8、小鼠在原平臺象限的停留時間及穿越原平臺位置的次數(shù)亦均沒有統(tǒng)計學差異。說明局灶性腦缺血導致空間學習記憶能力明顯受到損害，但氟西汀治療兩周對腦缺血引起的空間學習記憶損害沒有改’善作用。 氟西汀治療四周并停藥兩周后，MWM隱蔽平臺試驗氟西汀組逃避潛伏期和游泳路線的長度顯著短于溶劑對照組，接近假手術組，說明慢性氟西汀治療能改善腦缺血后的空間學習記憶損害；并且在三組之間游泳速度沒有顯著差異，排除了動物體力差異對空間學習記憶能力的影響；空間

9、探索試驗中氟西汀組在原平臺象限的停留時間及穿越原平臺位置的次數(shù)均顯著多于溶劑對照組。為了排除視覺對空間學習記憶的影響進行可視平臺試驗，結果顯示三組的逃避潛伏期沒有統(tǒng)計學差異，因此排除了視覺障礙對動物空間學習記憶能力的影響。 行為學實驗結束后取小鼠腦組織進行TTC染色顯示溶劑對照組與氟西汀組腦組織梗死面積的大小沒有顯著差異，以上研究結果說明慢性氟西汀治療對腦缺血后感覺運動功能的恢復沒有影響，但能改善腦缺血后的空間學習記憶損害，且不

10、是由于梗死面積的縮小引起的。 為了研究海馬神經(jīng)元再生與氟西汀改善腦缺血后空間學習記憶功能之間的相互關系。 首先，我們觀察了氟西汀給藥對腦缺血后神經(jīng)元再生的影響，我們在MCAO造模后19-21天(氟西汀給藥后第12-14天)給予5-溴脫氧尿核苷(5-bromo-2’-deoxyuridine，BrdU：一種公認的新生細胞標記物)50mg/kg，連續(xù)給藥6次，給藥間隔為12小時，標記新生細胞。最后一次BrdU注射24h和28

11、天后處死動物，觀察氟西汀是否調(diào)控海馬DG區(qū)細胞的增殖和存活。BrdU陽性細胞計數(shù)結果表明：三組之間缺血側(cè)及對側(cè)新生細胞的數(shù)目均沒有顯著差異，但氟西汀組缺血側(cè)及對側(cè)存活的細胞數(shù)與溶劑對照組相比，均顯著增多，對照組和假手術組之間存活的細胞數(shù)沒有差異，說明慢性氟西汀治療對缺血后海馬DG區(qū)神經(jīng)元的增殖沒有影響，但能促進新生細胞的存活。 其次，為了進一步探討氟西汀改善腦缺血后空間學習記憶功能是否依賴于海馬神經(jīng)元再生，我們運用端粒酶抑制劑3

12、-疊氮脫氧胸苷(3’-azido-3’-deoxytllymidine，AZT)阻斷海馬神經(jīng)元再生。本實驗室前期研究表明，在生理狀態(tài)下，端粒酶抑制劑AZT顯著抑制了小鼠海馬齒狀回神經(jīng)元的增殖及存活。造模后實驗動物共分為三組：溶劑對照組-MCAO造模后給予生理鹽水；氟西汀組(FLX組）-MCAO造模后給予氟西汀；FLX+AZT組-MCAO造模后先給予AZT半小時后再給予氟西汀，小鼠氟西汀給藥前半小時(MCAO后8-35天)腹腔注射AZT(

13、100mg/kg，給藥28次，間隔24小時)，第19-21天給予BrdU(50mg/kg，連續(xù)給藥6次，給藥間隔為12小時)標記新生細胞。末次BrdU注射28天后檢測海馬神經(jīng)元再生，并進行Morris水迷宮實驗。 結果顯示：氟西汀治療前半小時給予AZT，能夠削弱氟西汀誘導的缺血后DG區(qū)神經(jīng)元再生的上調(diào)，F(xiàn)LX+AZT組缺血側(cè)及對側(cè)Brdu陽性細胞數(shù)分別比FLX組減少了46％和37％，接近溶劑對照組。且在水迷宮實驗中，隱蔽平臺試驗

14、中與FLX組、溶劑對照組相比，F(xiàn)LX+AZT組逃避潛伏期及游泳路線的長度均顯著延長，以上結果說明AZT能夠削弱氟西汀誘導的缺血后DG區(qū)神經(jīng)元再生的上調(diào)，且此時氟西汀改善缺血后空間記憶損害的效應消失。 結論：慢性氟西汀治療對腦缺血后感覺運動功能的恢復沒有影響：腦缺血后慢性氟西汀治療不影響海馬DG區(qū)神經(jīng)元的增殖，但能夠促進新生細胞的存活，并逆轉(zhuǎn)缺血引起的空間學習記憶損害。海馬神經(jīng)元再生的上調(diào)是氟西汀改善缺血后空間學習記憶損害所必需的