地黃梓醇抗腦缺血并改善小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙及機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的:腦血管疾病是目前世界公認(rèn)的人類三大致死疾病之一。腦缺血患者存在神經(jīng)功能缺失,偏癱感覺(jué)減退和認(rèn)知功能損傷等癥狀,影響日?；顒?dòng)或運(yùn)動(dòng)功能康復(fù),嚴(yán)重的可引起死亡,危害人類的健康。臨床上目前缺醫(yī)少藥,缺乏既能促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù),又能改善認(rèn)知功能的藥物。梓醇是中藥地黃的主要活性成分之一,具有神經(jīng)保護(hù)、促進(jìn)缺血腦區(qū)血管新生、改善記憶等藥理作用,因此可以作為一個(gè)潛在的新藥物來(lái)治療中風(fēng)和提高記憶能力。
　　 本實(shí)驗(yàn)分別選擇目前臨床用于

2、治療中風(fēng)(依達(dá)拉奉,edaravone)和促智的藥物(奧拉西坦,oxiracetam)為陽(yáng)性對(duì)照,研究梓醇能否治療腦缺血,并改善學(xué)習(xí)記憶功能,旨在與現(xiàn)有臨床藥物比較,探討梓醇治療腦相關(guān)疾病的優(yōu)勢(shì)。在此基礎(chǔ)上探討梓醇改善記憶的可能機(jī)制。
　　 方法:
　　 第一部分:梓醇與依達(dá)拉奉、奧拉西坦治療小鼠腦缺血的比較研究
　　 (1)模型制備與給藥小鼠分為5組;假手術(shù)組,模型組,奧拉西坦組,依達(dá)拉奉組,梓醇治療組。采用經(jīng)

3、頸內(nèi)動(dòng)脈線栓法制備小鼠左側(cè)的大腦中動(dòng)脈閉塞腦缺血模型,于術(shù)后24h開(kāi)始尾靜脈注射藥物,連續(xù)3天。
　　 (2)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分小鼠術(shù)后1、2、3天參照Z(yǔ)ea longa的5分制標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分,評(píng)價(jià)各組神經(jīng)功能恢復(fù)狀況。
　　 (3)激光多普勒血流儀(LDF)檢測(cè)小鼠局部腦血流量術(shù)后第3天采用LDF檢測(cè)小鼠局部腦血流量(rCBF)。
　　 (4)小鼠大腦梗死面積測(cè)定每組5只小鼠腦切片置于0.5%2,3,5-氯

4、代三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC)中染色測(cè)定腦梗死面積。
　　 (5)大腦缺血側(cè)海馬組織HE和尼氏染色每組5只小鼠大腦進(jìn)行冰凍切片,HE和尼氏染色,鏡下觀察大腦缺血側(cè)海馬組織神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)。
　　 第二部分:梓醇與依達(dá)拉奉、奧拉西坦治療小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的比較研究
　　 (1)記憶障礙模型制各與藥物干預(yù)小鼠分為7組:正常對(duì)照組,模型組,奧拉西坦組,依達(dá)拉奉組,梓醇低

5、、中、高劑量組。造模前每組尾靜脈注射藥物(正常對(duì)照組和模型組給予等體積生理鹽水),連續(xù)3天后,進(jìn)行Morris水迷宮,每次測(cè)試前腹腔注射氫溴酸東莨菪堿2 mg/kg·次),制備記憶障礙模型。
　　 (2)Morris水迷宮測(cè)試水迷宮測(cè)試分為定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn),前3天為定位航行實(shí)驗(yàn),第4天為空間探索實(shí)驗(yàn)。
　　 第三部分:梓醇改善小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的機(jī)制研究
　　 (1)水迷宮測(cè)試結(jié)束后,將各組小鼠眼眶取血,

6、分離大腦海馬待用。
　　 (2)比色法檢測(cè)小鼠的乙酰膽堿酯酶(AChE)和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)的活性;ELISA定量檢測(cè)乙酰膽堿(Ach)和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)含量.
　　 (3)Western blot半定量檢測(cè)小鼠大腦海馬的膽堿受體M1、M2、ChAT和AChE的蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 (1)梓醇對(duì)腦缺血小鼠的神經(jīng)行為學(xué)的影響
　　 采用Zea longa神經(jīng)功能評(píng)分評(píng)

7、定腦缺血后1、2和3天各實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)缺失功能恢復(fù)狀況,證實(shí)梓醇對(duì)腦缺血后功能恢復(fù)有促進(jìn)作用。在腦缺血后第3天,梓醇高劑量組和依達(dá)拉奉組的Zea longa神經(jīng)功能分?jǐn)?shù)分別為2.10±0.32和2.00±0.47,與模型組(2.50±0.53)比較差異有顯著性(P＜0.01);而奧拉西坦組(2.22±0.44)與模型組差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。提示梓醇和依達(dá)拉奉可促進(jìn)腦缺血小鼠神經(jīng)功能恢復(fù),而奧拉西坦不明顯。
　　 (2)梓醇對(duì)

8、腦缺血小鼠腦血流值變化率的影響
　　 在腦缺血后第3天測(cè)量小鼠局部腦血流值,與模型組小鼠的腦血流值變化率(88.59%±0.55%)相比,依達(dá)拉奉組(72.56%±3.24%,P＜0.05)和梓醇高劑量組(60.99%±1.99%,P＜0.05)明顯降低,而與奧拉西坦組(89.83%4.50%)差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。提示梓醇和依達(dá)拉奉明顯改善腦缺血后小鼠腦血流值,而奧拉西坦不明顯。
　　 (3)梓醇對(duì)小鼠腦梗死面

9、積的影響
　　 腦缺血后第3天測(cè)量腦梗死面積,與假手術(shù)組(0±0)比較,其他各實(shí)驗(yàn)組的梗死面積明顯增大(P＜0.01)。與模型組(18.20%±0.42%)相比,依達(dá)拉奉組(10.65%±0.58%)和梓醇高劑量組(11.14%±0.5%)梗死面積均明顯降低(P＜0.05),而奧拉西坦組(18.19%±0.4l%)差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。提示梓醇治療明顯減少小鼠腦梗死面積,而奧拉西坦不明顯。
　　 (4)梓醇對(duì)小鼠

10、大腦缺血側(cè)的海馬組織神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響
　　 HE染色:假手術(shù)組海馬神經(jīng)元細(xì)胞排列致密、整齊,結(jié)構(gòu)正常,胞體較大,染色質(zhì)分布均勻,核仁明顯;模型組神經(jīng)細(xì)胞變性壞死,周?chē)g隙擴(kuò)大,胞漿和胞核皺縮、染色加深,細(xì)胞體積縮小,細(xì)胞數(shù)量減少;奧拉西坦組神經(jīng)細(xì)胞較模型組整齊,但也可見(jiàn)神經(jīng)元變性壞死;與模型組和奧拉西坦組比較,依達(dá)拉奉組和梓醇組的海馬神經(jīng)細(xì)胞明顯整齊,排列致密,形態(tài)較正常,胞體較大,染色質(zhì)分布均勻,核仁比較明顯。尼氏染色結(jié)果同

11、時(shí)顯示,假手術(shù)組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整,胞體體積較大,細(xì)胞輪廓清楚,尼氏小體呈深藍(lán)色斑塊;模型組神經(jīng)元,胞體變小、胞核固縮、胞漿減少,神經(jīng)元數(shù)量較假手術(shù)組比較明顯減少;奧拉西坦組同模型組相似,神經(jīng)元減少,排列紊亂疏松;依達(dá)拉奉組和梓醇組的神經(jīng)元的存活數(shù)量較模型組比較明顯增加,整齊形態(tài)規(guī)整,胞漿均勻。提示梓醇和依達(dá)拉奉能明顯改善小鼠大腦海馬組織神經(jīng)細(xì)胞的損傷程度,而奧拉西坦不明顯。
　　 (5)梓醇對(duì)小鼠水迷宮的影響
　　 定位航

12、行實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果顯示,模型組小鼠逃避潛伏期(108.40 s±11.34 s)與正常對(duì)照組(102.47 s±20.62 s)比較差異有顯著性(P＜0.05);第3天,與模型組(102.07 s±13.93 s)比較,奧拉西坦組(74.36 s±8.29 s)和梓醇中高劑量組(76.66s±19.27 s和66.20 s±13.20 s)均顯著縮短小鼠找到隱匿平臺(tái)時(shí)間(P＜0.05),但模型組與依達(dá)拉奉組(89.63 s±20.86 s)

13、無(wú)明顯差異(P＞0.05)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果顯示,模型組小鼠跨越原平臺(tái)次數(shù)(0.40±0.70)與正常對(duì)照組(3.89±1.97)比較差異顯著(P＜0.01),奧拉西坦組(3.30±1.16)和梓醇各劑量組(2.33±0.86、3.40±0.70、4.70±0.67)均能顯著增加跨越平臺(tái)次數(shù)(P＜0.05)。提示梓醇具有改善學(xué)習(xí)記憶的能力。
　　 (6)比色法檢測(cè)梓醇對(duì)乙酰膽堿酯酶和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活性的影響
　　 與

14、模型組(0.454±0.202)比較,奧拉西坦組的小鼠海馬中的AChE的蛋白活性(0.293±0.063)明顯降低(P＜0.05),而其它各實(shí)驗(yàn)組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。與正常對(duì)照組(0.322±0.039)比較,模型組的小鼠海馬的ChAT的蛋白活性(0.173±0.024)明顯降低(P＜0.05);與模型組相比,奧拉西坦組(0.284±0.017)和梓醇中、高劑量組(0.279±0.043和0.319±0.067)明顯升高(P

15、＜0.05);而與依達(dá)拉奉組(0.367±0.081)比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)。提示梓醇和奧拉西坦可明顯降低海馬中ChAT的蛋白活力,而依達(dá)拉奉卻不明顯。
　　 (7)ELISA檢測(cè)梓醇對(duì)Ach及BDNF影響
　　 與模型組比較,梓醇中、高劑量組和奧拉西坦組的小鼠大腦海馬Ach和BDNF含量都明顯增加(P＜0.01);且梓醇中、高劑量組和奧拉西坦組小鼠大腦海馬Ach及BDNF含量均超過(guò)正常對(duì)照組,梓醇治療組和奧拉西

16、坦組Ach含量與BDNF含量組間比較差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。BDNF與Ach的含量進(jìn)行線性回歸分析顯示二者有較強(qiáng)相關(guān)性(r=0.859,P＜0.05)。提示梓醇能改善丁溴東莨菪堿誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶機(jī)能障礙,明顯上調(diào)腦海馬Ach和BDNF水平。
　　 (8)Westernblot檢測(cè)梓醇對(duì)大腦海馬的膽堿受體M1、M2、ChAT和AChE的影響
　　 與正常對(duì)照組(M1;0.98±0.05,M2;0.49±0.01)比較,

17、模型組的小鼠海馬的M1、M2受體的相對(duì)蛋白條帶光密度值(0.24±0.00和0.24±0.00)均顯著增加(P＜0.01)。與模型組相比,梓醇低、中、高劑量組和奧拉西坦組的小鼠大腦海馬M1受體相對(duì)蛋白條帶光密度值(0.35±0.00、0.56±0.02、0.73±0.01和0.45±0.02)、M2受體相對(duì)蛋白條帶光密度值(0.33±0.01、0.42±0.01、0.62±0.03和0.32±0.02)明顯增加(P＜0.01),依達(dá)拉奉

18、組的M1受體(0.46±0.01)蛋白表達(dá)也明顯增加(P＜0.01)。提示梓醇能明顯上調(diào)M1、M2受體的蛋白表達(dá)。
　　 與正常對(duì)照組(0.19±0.00)比較,模型組的小鼠海馬的AChE的蛋白條帶光密度值(0.22±0.01)顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較,梓醇低、中、高劑量組(0.12±0.00、0.08±0.00和0.19±0.01)和奧拉西坦組(0.15±0.00)的小鼠大腦海馬AChE的蛋白條帶光密度值明顯降低

19、(P＜0.01),而依達(dá)拉奉組的AChE的蛋白條帶光密度值(0.29±0.02)卻明顯增加(P＜0.01)。提示梓醇能明顯降低AChE的蛋白表達(dá)。
　　 與正常對(duì)照組(0.83±0.03)比較,模型組的小鼠海馬的ChAT的蛋白條帶光密度值(0.53±0.03)顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較,梓醇高劑量組(0.62±0.02),奧拉西坦組(1.06±0.01)和依達(dá)拉奉組(0.60±0.03)的小鼠大腦海馬ChAT蛋白條帶