單克隆抗體親和填料的制備及其在血漿高豐度蛋白分離中的初步研究.pdf

1、血漿中存在約上萬種蛋白質(zhì)，濃度從pg/mL到mg/mL，在血漿蛋白質(zhì)組學(xué)研究中低豐度蛋白的檢測(cè)常被高豐度蛋白干擾。因此，有必要對(duì)血漿樣品進(jìn)行預(yù)分離。預(yù)分離的目標(biāo)是去除高豐度蛋白或直接富集低豐度蛋白。 去除高豐度蛋白的方法有密度梯度離心、化學(xué)沉淀、膜截留、配體吸附(染料、抗體、多肽等)等。直接富集低豐度蛋白的方法有凝集素富集糖蛋白、金屬表面吸附磷酸化蛋白、疏水微球吸附多肽或小分子蛋白等。血漿蛋白質(zhì)組學(xué)研究目前常用高豐度蛋白去除后的

2、樣品進(jìn)行。國(guó)外采取多克隆抗體(IgG，IgY)制備的親和填料進(jìn)行預(yù)分離。經(jīng)一系列評(píng)價(jià)后發(fā)現(xiàn)具有很高的結(jié)合特異性，但也存在一定缺點(diǎn)如各操作系統(tǒng)間不兼容，有非特異吸附，抗體失活速率不均一等。目前未見國(guó)內(nèi)有制備血漿高豐度蛋白質(zhì)去除填料的相關(guān)研究報(bào)導(dǎo)，這與國(guó)內(nèi)快速發(fā)展的蛋白質(zhì)組學(xué)研究不相稱。 高豐度蛋白在樣品中含量高，需高載量的親和填料才能實(shí)現(xiàn)較理想的分離?？贵w分子共價(jià)固定常用CNBr活化的瓊脂糖法，但如果是抗體Fab段氨基而不是Fc段

3、氨基與填料CNBr基團(tuán)反應(yīng)，就會(huì)因空間阻礙而失去一定的結(jié)合能力，不同抗體的Fab段氨基活性與Fc段氨基活性不同，因此抗體結(jié)合活性與這兩區(qū)域的氨基活性比有關(guān)。利用抗體的Fc段糖基可實(shí)現(xiàn)定向固定，糖基氧化為醛基后與載體上氨基連接，但該方法在實(shí)際反應(yīng)過程中會(huì)發(fā)生自偶聯(lián)現(xiàn)象，即抗體分子間的氨基和醛基形成多聚體，使抗體結(jié)合活性下降，且單克隆抗體的糖基含量不同，固定效率也不同。以PreinG/A吸附抗體，然后用DMP(Dimethylpimelin

4、ediimidatechloride，庚二亞氨酸二甲酯二鹽酸鹽)使之與ProteinG/A蛋白共價(jià)交聯(lián)，使抗體定向固定在ProteinG/A，反應(yīng)條件較溫和。 親和填料在高豐度蛋白去除過程中存在非特異吸附蛋白的現(xiàn)象，主要是樣品與容器表面，樣品與支持填料，樣品中蛋白與蛋白相互作用。不同親和填料、色譜系統(tǒng)和樣品處理所表現(xiàn)的非特異吸附各不相同，因此研究者提出“分離’’而非“去除，，的高豐度蛋白分離策略。因此鑒定每種親和填料及其操作系統(tǒng)

5、的非特異吸附蛋白群是后續(xù)蛋白質(zhì)組研究的必要數(shù)據(jù)。相比于多克隆抗體，單克隆抗體技術(shù)成熟可靠，易大量制備和質(zhì)量控制，與抗原的特定表位結(jié)合，具有有更可靠的吸附蛋白重復(fù)性。 研究目的及意義： 1)進(jìn)行抗體固定方法的比較，選擇有效的抗體固定方法。 2)篩選合適的單抗，使填料具有最大的吸附量和反復(fù)吸附-洗脫能力。 3)鑒定該單克隆抗體制備的親和填料吸附蛋白，為后續(xù)血漿蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供數(shù)據(jù)。 材料和方法：

6、 1)參考CNBr-activatedSepharose4FastFlow(GEHealthcare，USA)、CarboLinkTMCouplingGel(PIERCECat20391)和POROSR20XLMediaImmobilizingAntibodyforPerfusionImmunoassays技術(shù)手冊(cè)，用1mg抗白蛋白抗體固定于6mL膠(50％體積)，電泳檢測(cè)抗體吸附能力。 2)14株抗白蛋白單克隆抗體和15株

7、抗球蛋白抗體用ProteinG/A-mAb法固定(1mg抗體：0.6mL膠)，制備好的膠放入SpinXTube中，加入15μL人血漿，孵育30分鐘后3000g離心1分鐘，收集流穿液1；加入0.1MPBS300μL，混勻1分鐘，3000g離心1分鐘，收集流穿液2；重復(fù)3次；加入0.1MGly-HCIpH2.5洗脫，收集洗脫液。合并流穿液1-4組份為分離高豐度蛋白后的血漿樣品。SDS-PAGE分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 3)用0.2mg，0.5

8、mg，1mg，5mg白蛋白和球蛋白對(duì)固定的2種白蛋白、4種球蛋白抗體載量進(jìn)行測(cè)試。 4)洗脫樣品經(jīng)雙向電泳后進(jìn)行MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定，每個(gè)點(diǎn)選3-6個(gè)母離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，經(jīng)Mascot檢索后確定蛋白質(zhì)。 結(jié)果： 1)ProteinG/A-mAb法固定有效抗體最多。 2)白蛋白，球蛋白單克隆抗體進(jìn)行篩選后顯示抗白蛋白抗體HPSIIB002、HPSIIB007；抗球蛋白抗體HPSIA010

9、、HPSIA020、HPSIA025、HPSIIB011有良好的吸附-洗脫行為；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示400μL，(1mg白蛋白單體、0.333mg球蛋白單抗)膠能分離10μL血漿中的白蛋白；處理后的血漿樣品在SDS-PAGE和2-DE實(shí)驗(yàn)中能明顯消除高豐度蛋白帶來的影響；重復(fù)使用十次后結(jié)合能力無明顯降低，但免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示高豐度蛋白碎片在流穿液中增加； 3)HPSIIB007白蛋白抗體和HPSIA010球蛋白抗體具有較高載量，最高結(jié)合摩

10、爾比例分別為1:1.5和1:05左右。 4)對(duì)非特異的吸附的蛋白進(jìn)行了2-DE，MALDI-TOF/TOF鑒定，檢測(cè)的110個(gè)點(diǎn)中，89個(gè)為白蛋白，球蛋白及其碎片，占80.9％。未檢出7個(gè)點(diǎn)，檢出率為93.6％。表明存在與填料非特異吸附，確定的吸附蛋白為：抗胰蛋白酶，VitaminD結(jié)合蛋白，CD5抗原相似蛋白，纖維蛋白原，keratin10，前脂蛋白，Transthyrentin，脂蛋白A-1，補(bǔ)體C3，轉(zhuǎn)鐵蛋白。 結(jié)

11、論：篩選出2株白蛋白單克隆抗體和4株球蛋白抗體適合親和填料的吸附-洗脫操作；確定了ProteinG/A-mAb法固定有效抗體最多；測(cè)試了親和填料的載量和十次吸附-洗脫去除實(shí)驗(yàn)，吸附載量無明顯下降，可適合多次重復(fù)操作；確定了該填料和操作平臺(tái)下的非特異吸附蛋白圖譜，為血漿蛋白質(zhì)組研究提供必要數(shù)據(jù)。本研究用單克隆抗體實(shí)現(xiàn)了高豐度蛋白的去除填料的研發(fā)，操作方便，不需復(fù)雜色譜設(shè)備，為血漿蛋白學(xué)研究提供了有效的平臺(tái)。該親和填料已在本校中醫(yī)系的血漿蛋