益氣補腎中藥對大鼠海馬神經(jīng)元缺氧復(fù)氧損傷的保護作用.pdf

1、目的： 1.觀察益氣補腎中藥-腦神康對體外培養(yǎng)缺氧復(fù)氧損傷大鼠海馬神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞存活率及乳酸脫氫酶（LDH）活力的影響。 2.觀察腦神康對體外培養(yǎng)缺氧復(fù)氧損傷大鼠海馬神經(jīng)元超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量的影響。 3.觀察腦神康對體外培養(yǎng)缺氧復(fù)氧損傷大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率、凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）mRNA表達的影響。 方法： 1.成年雄性

2、Wistar大鼠隨機分為2組，分別予腦神康及同等量生理鹽水灌胃，取血制備大鼠正常血清和含藥血清。選取出生24h內(nèi)新生Wistar大鼠（雌雄不限），75％乙醇消毒后，剝離頭皮及顱骨，取出完整腦組織，鈍性分離海馬，原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元，通過差速貼壁法進行純化并加入阿糖胞苷抑制非神經(jīng)元細(xì)胞的生長，免疫組織化學(xué)法進行神經(jīng)元微管相關(guān)蛋白（MAP-2）鑒定，證實培養(yǎng)的細(xì)胞為神經(jīng)元并確定其純度，取培養(yǎng)8天的神經(jīng)元用于實驗。 2.根據(jù)藥物不同

3、濃度將神經(jīng)元隨機分為5組： ①對照組：正常換液培養(yǎng)； ②損傷組：于培養(yǎng)第8d建立缺氧復(fù)氧損傷模型：造模前換以無血清培養(yǎng)液，然后置于充以95％N。和5％ CO2的乏氧培養(yǎng)箱內(nèi)（箱內(nèi)氧氣含量低于1％），37℃培養(yǎng)6h后取出，換以含10％正常大鼠血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，置37℃ 5％ CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h； ③中藥低、中、高濃度組：建立缺氧復(fù)氧損傷模型，在復(fù)氧前分別加入含低（5％）、中（10％）、高（20

4、％）三個濃度含藥血清的DMEM/F12培養(yǎng)液。 3.每組細(xì)胞均在倒置相差顯微鏡下動態(tài)觀察一般形態(tài)學(xué)變化，MTT檢測各組神經(jīng)元存活率，試劑盒測定MDA含量及SOD、LDH活性，流式細(xì)胞儀測凋亡率，PT-PCR法半定量檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及BDNF mRNA的表達。 結(jié)果： 1.不同濃度的含藥血清作用24h后，可觀察到損傷神經(jīng)元形態(tài)改變減輕，MTT結(jié)果顯示益氣補腎中藥可明顯提高神經(jīng)元存活率（均P<0.0

5、1），且中藥各濃度組均較損傷組LDH活力下降（均P<0.01），表明中藥腦神康發(fā)揮了對損傷神經(jīng)元的保護作用。 2.數(shù)據(jù)結(jié)果顯示損傷組MDA含量比對照組明顯升高而SOD活性則明顯下降（均P<0.01），中藥各濃度組所測得的MDA含量較損傷組降低（均P<0.01），SOD活性升高（均P<0.01），且具有明顯的劑量依賴性。 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，損傷組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.01），中藥各濃度組可顯著降低神經(jīng)元的凋

6、亡率（均P<0.01）。PT-PCR結(jié)果表明，與對照組相比，損傷組神經(jīng)元促凋亡基因Bax的mRNA表達量明顯增加（P<0.01），而抑制凋亡基因Bcl-2的mRNA表達量則明顯下降（P<0.01），Bcl-2/Bax比值降低（P<0.01）；與損傷組相比，中藥各濃度組均可增加Bcl-2的mRNA表達量（均P<0.01），降低Bax的mRNA表達量（均P<0.01），使Bcl-2/Bax比值升高（均P<0.01），具有明顯的量效關(guān)系。且與