手掌參中赤霉酸誘導(dǎo)的富含半胱氨酸蛋白的表達(dá)、純化及鑒定.pdf

1、在前期篩選手掌參cDNA文庫(kù)獲得編碼赤酶酸誘導(dǎo)的富含半胱氨酸蛋白的基因gcgasa基礎(chǔ)上，研究基因本身的信號(hào)肽對(duì)gcgasa基因原核表達(dá)的影響。
　　方法：設(shè)計(jì)帶有EcoR I和Hind III酶切位點(diǎn)的引物，分別對(duì)gcgasa基因編碼區(qū)全長(zhǎng)(gcgasa)及信號(hào)肽缺失的cDNA片段(?gcgasa)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將目標(biāo)片段克隆入原核表達(dá)載體pET-32(a)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32(a)/gcgasa、pET-32(a)/?

2、gcgasa。經(jīng)測(cè)序鑒定后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，采用SDS-PAGE及 Western-blotting鑒定外源蛋白的表達(dá)，并通過(guò)電鏡超薄切片技術(shù)檢測(cè)包涵體在細(xì)胞內(nèi)的定位。對(duì)于水溶性蛋白，進(jìn)一步采用親合層析手段進(jìn)行初步純化。
　　結(jié)果:測(cè)序鑒定外源基因成功插入表達(dá)載體。SDS-PAGE及Western-blotting結(jié)果表明：含有信號(hào)肽的外源基因在大腸桿菌中以不可溶包涵體形式存在，而信號(hào)肽