手掌參中赤霉酸誘導的富含半胱氨酸蛋白的表達、純化及鑒定.pdf

1、在前期篩選手掌參cDNA文庫獲得編碼赤酶酸誘導的富含半胱氨酸蛋白的基因gcgasa基礎上，研究基因本身的信號肽對gcgasa基因原核表達的影響。
　　方法：設計帶有EcoR I和Hind III酶切位點的引物，分別對gcgasa基因編碼區(qū)全長(gcgasa)及信號肽缺失的cDNA片段(?gcgasa)進行PCR擴增，將目標片段克隆入原核表達載體pET-32(a)，構建重組質粒pET-32(a)/gcgasa、pET-32(a)/?

2、gcgasa。經(jīng)測序鑒定后，轉化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導表達融合蛋白，采用SDS-PAGE及 Western-blotting鑒定外源蛋白的表達，并通過電鏡超薄切片技術檢測包涵體在細胞內的定位。對于水溶性蛋白，進一步采用親合層析手段進行初步純化。
　　結果:測序鑒定外源基因成功插入表達載體。SDS-PAGE及Western-blotting結果表明：含有信號肽的外源基因在大腸桿菌中以不可溶包涵體形式存在，而信號肽