MUC4多表位嵌合疫苗誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CTL）體外殺傷功能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、粘蛋白(mucin，MUC)為高度糖基化的大分子糖蛋白，覆蓋在粘膜上皮表面，作用包括保護(hù)粘膜上皮、參與上皮細(xì)胞的更新分化以及調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附、免疫反應(yīng)和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等。目前共發(fā)現(xiàn)20余種粘蛋白，包括：MUCl-2、MUC3/17、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC6-16、MUCl8-20等。 1991年P(guān)orchet等首先從人類支氣管cDNA文庫(kù)中獲得MUC4cDNA，定位于3q29的候選癌基因，與

2、鼠唾液酸粘蛋白復(fù)合物SMC具有60％同源性。MUC4基因可以通過不同的轉(zhuǎn)錄后剪接方式編碼三種不同的MUC4蛋白亞型：膜結(jié)合型，分泌型和無特征結(jié)構(gòu)型，在人體內(nèi)分布最為廣泛的是膜結(jié)合型，其分子結(jié)構(gòu)包括一個(gè)分子量為850KD的胞外部分MUC4ct和分子量為80KD的跨膜部分MUC4β。目前研究發(fā)現(xiàn)MUC4蛋白具有重要的生物學(xué)功能，包括抑制細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的連接，幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫細(xì)胞攻擊，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，抑制細(xì)胞凋亡等，在

3、腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。 腫瘤疫苗是目前抗腫瘤研究的一個(gè)活躍領(lǐng)域，可分為細(xì)胞疫苗、蛋白疫苗、肽疫苗和核酸疫苗等幾大類，而表位疫苗是目前核酸疫苗的一個(gè)研究方向，其中多表位嵌合疫苗是指同時(shí)攜帶多個(gè)抗原相關(guān)表位以及輔助性表位的疫苗，這類疫苗在誘導(dǎo)細(xì)胞免疫方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，包括：1、內(nèi)源性的表位呈遞可以避免表位肽被降解，而且有研究顯示DNA疫苗能為APC提供長(zhǎng)時(shí)期的內(nèi)源性抗原表達(dá)，誘導(dǎo)CD4細(xì)胞產(chǎn)生Thl細(xì)胞因子，通過“交叉呈

4、遞和交叉激活”而活化CTL;2、去除非免疫相關(guān)成分，減少免疫耐受和自身免疫的發(fā)生，引入各種免疫輔助成分，增強(qiáng)免疫應(yīng)答效果；3、設(shè)計(jì)和制備方便，可以有不同HLA限制性表位，有廣譜性。因此多表位嵌合疫苗成為目前疫苗研究的一個(gè)熱點(diǎn)。 樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells)是已知體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原呈遞細(xì)胞(Antigen.presenting cell，APC)，其抗原呈遞能力是巨噬細(xì)胞的10-100倍，在啟動(dòng)抗腫瘤的細(xì)胞免疫

5、中起著關(guān)鍵作用，目前在腫瘤的免疫治療研究中廣為使用，成為研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。以腫瘤相關(guān)抗原誘導(dǎo)特異性CTL產(chǎn)生而發(fā)揮抗腫瘤的作用已經(jīng)有報(bào)道，并取得一定的研究成果。MUC4特異性表達(dá)于各種腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系，特別在胰腺腫瘤中，由于MUC4在慢性胰腺炎和正常胰腺中不表達(dá)，在胰腺癌組織中高表達(dá)，被視為胰腺癌相關(guān)抗原而成為胰腺癌基因治療和免疫治療的一個(gè)新靶標(biāo)。已有研究證明在MUC4表達(dá)的腫瘤組織中，MUC4蛋白可以激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫

6、。高表達(dá)MUC4的HPAF細(xì)胞是具有強(qiáng)轉(zhuǎn)移特性的胰腺癌細(xì)胞系，在轉(zhuǎn)染反義MUC4 mRNA后，MUC4蛋白表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞增殖克隆能力變?nèi)?，接種小鼠后表現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)緩慢，轉(zhuǎn)移能力降低。上述研究證明對(duì)于表達(dá)MUC4蛋白的腫瘤，MUC4有作為基因治療靶點(diǎn)的潛力。 本研究中，我們首先利用生物信息學(xué)分析MUC4蛋白序列，獲得HL-A-Al和HLA-A2限制性表位，這些表位和通用Th輔助表位PADRE直接串接成多表位嵌合基因并構(gòu)建腺病毒載體，

7、SDS-page凝膠電泳檢測(cè)其在真核細(xì)胞中的表達(dá)，并利用重組腺病毒感染DC細(xì)胞，TNF-a誘導(dǎo)成熟后體外刺激自身來源的PBLs，獲得特異性CTL。標(biāo)準(zhǔn)Cr51釋放實(shí)驗(yàn)和Elispot檢測(cè)CTL對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用。 結(jié)果： 重組多表位嵌合基因腺病毒轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞COS-7，可以表達(dá)目的蛋白。多表位嵌合基因轉(zhuǎn)染DC，TNF-α刺激成熟并外照射后，體外與自身來源的PBLs共同作用刺激特異性CTL產(chǎn)生， Cr51實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組

8、rAd-CMV-MUC4/PADRE誘導(dǎo)CTL殺傷MUC4和HLA-A2雙陽(yáng)性靶細(xì)胞HCT-116與單陽(yáng)性靶細(xì)胞BXPC-3，MCF-7有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而對(duì)照組rAd-CMV-GFP和IL-2組沒有差異，顯示CTL殺傷有特異性。Elispot檢測(cè)rAd-CMV-MUC4/PADRE、rAd-CMV-GFP、空白組分別和HCT-116作用后IFN-γ表達(dá)，當(dāng)效靶比為40/1時(shí)，rAd-CMV-MUC4/PADRE組IFN-γ分泌量和其余