EpCAM特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)EpCAMhigh腺癌細(xì)胞的體外殺傷實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:研究體外誘導(dǎo)生成的EpCAM抗原特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)EpCAMhigh腺癌細(xì)胞的體外殺傷效率。比較EpCAM抗原特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞及EpCAMhigh腺癌細(xì)胞全抗原特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)EpCAMhigh腺癌細(xì)胞的殺傷效率，并比較EpCAM抗原特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)EpCAMhigh腺癌細(xì)胞及EpCAMlow腺癌細(xì)胞殺傷效率。
　　方法:體外培養(yǎng)多種腺癌細(xì)胞株，流式法檢測(cè)各種細(xì)胞株表面EpCAM的表達(dá)量，分別選擇EpCAM高表達(dá)

2、的(EpCAMhigh)LS174-T結(jié)腸腺癌細(xì)胞及EpCAM低表達(dá)(EpCAMlow)的PaCa-2胰腺癌細(xì)胞作為靶細(xì)胞。采集健康成人外周血，經(jīng)梯度密度離心法收集單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，貼壁法分離淋巴細(xì)胞及imDCs。體外誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞中T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CIK細(xì)胞并擴(kuò)增[2]。以LS174-T細(xì)胞裂解物負(fù)載imDCs促進(jìn)其成熟，生成LS174-T腺癌細(xì)胞裂解物-mDCs(LS-mDCs)，LS-mDCs與自體CIK細(xì)胞進(jìn)行體外共培養(yǎng)，向C

3、IK細(xì)胞提呈LS174-T腫瘤全抗原信息，部分CIK細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有LS174-T全抗原特異性殺傷活性的CTL，從而制備LS174-T腺癌細(xì)胞全抗原特異性DC-CIK-CTL效應(yīng)細(xì)胞(LS-effector)。相似的方法，以純化EpCAM多肽抗原負(fù)載imDCs促進(jìn)其成熟，生成EpCAM-mDCs(Ep-mDCs)，Ep-mDCs與自體CIK細(xì)胞體外共培養(yǎng)，向CIK細(xì)胞提呈EpCAM抗原信息，部分CIK轉(zhuǎn)化為具有EpCAM特異性殺傷活性的C

4、TL，從而制備成純化EpCAM抗原特異性DC-CIK-CTL效應(yīng)細(xì)胞（Ep-effector）。流式細(xì)胞術(shù)（Flow CytoMetry，F(xiàn)CM）分別檢測(cè)imDCs、LS-mDCs及Ep-mDCs表面CD80、CD86、CD83、HLA-DR的表達(dá)量，對(duì)其差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。設(shè)單純CIK組、LS-effector組及Ep-effector組，流式法分別檢測(cè)day0、day7、day14(d0、d7、d14)單純CIK組中CD3+CD8+

5、T細(xì)胞及CD3+CD56+細(xì)胞比例變化，LS-effector組及Ep-effector組中CD3+CD8+T細(xì)胞及CD3+CD4+T細(xì)胞比例變化，CD3+CD4+T/CD3+CD8+T比值變化，分別對(duì)其差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。細(xì)胞毒試驗(yàn)（CCK-8法）檢測(cè)不同效靶比時(shí)各組效應(yīng)細(xì)胞對(duì) EpCAMhigh的LS174-T及EpCAMlow的PaCa-2的殺傷效率，對(duì)其差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1 LS174-T細(xì)胞Ep

6、CAM表達(dá)量為99.95％，PaCa-2細(xì)胞EpCAM表達(dá)量為6.70％。
　　2 LS-mDCs及Ep-mDCs表面CD80、CD86、CD83、HLA-DR的表達(dá)量均較未負(fù)載抗原的imDCs明顯增多，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，LS-mDCs及Ep-mDCs表面CD80、CD86、CD83、HLA-DR的表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　3體外培養(yǎng)d0、d7、d14后各組效應(yīng)細(xì)胞表型發(fā)生變化。d14單純

7、CIK組中CD3+CD8+T細(xì)胞比例為80.47±1.38％，高于d0的CD3+CD8+T細(xì)胞比例25.10±0.53％（P＜0.05），CD3+CD56+細(xì)胞比例為13.37±0.61％,高于d0的CD3+CD56+T細(xì)胞比例為5.73±0.68％(P＜0.05)。LS-effector組中CD3+CD8+T細(xì)胞比例為76.60±2.96％, Ep-effector組中CD3+CD8+T細(xì)胞比例為81.80±2.63％，均高于d0的C

8、D3+CD8+T細(xì)胞比例為25.10±0.53％(P＜0.05，P＜0.05)，LS-effector組中CD3+CD4+T細(xì)胞比例為23.33±1.80％，Ep-effector組中CD3+CD4+T細(xì)胞比例為25.77±1.50％，均低于d0的CD3+CD4+T細(xì)胞比例為30.07±0.85％(P＜0.05，P＜0.05)。LS-effector組中CD3+CD4+T/CD3+CD8+T比值為0.30±0.03，Ep-effecto

9、r組中CD3+CD4+T/CD3+CD8+T比值為0.30±0.01，均低于d0的CD3+CD4+T/CD3+CD8+T比值為1.20±0.02(P＜0.05，P＜0.05)。
　　4隨效靶比(E∶T)增高，各組效應(yīng)細(xì)胞的殺傷效率均升高。單純CIK組對(duì)LS174-T的殺傷效率E∶T=5∶1時(shí)為39.59±9.37％，E∶T=10∶1時(shí)為49.48±11.71％，E∶T=20∶1時(shí)為69.39±6.65％，E∶T=20∶1時(shí)單純CI

10、K組對(duì)LS174-T的殺傷效率高于E∶T=5∶1(P＜0.05)。單純CIK組對(duì)PaCa-2的殺傷效率E∶T=5∶1時(shí)為37.68±6.09％，E∶T=10∶1時(shí)為47.10±7.61％，E∶T=20∶1時(shí)為66.33±10.04％。E∶T=20∶1時(shí)單純CIK組對(duì)PaCa-2的殺傷效率高于E∶T=5∶1(P＜0.05)。LS-effector組對(duì)LS174-T的殺傷效率E∶T=5∶1時(shí)為53.01±6.91％，E∶T=10∶1時(shí)為66

11、.26±8.64％，E∶T=20∶1時(shí)為74.71±8.36％，E∶T=20∶1時(shí)LS-effector組對(duì)LS174-T的殺傷效率高于E∶T=5∶1(P＜0.05)。LS-effector組對(duì)PaCa-2的殺傷效率E∶T=5∶1時(shí)為41.99±6.87％，E∶T=10∶1時(shí)為52.48±8.58％，E∶T=20∶1時(shí)為65.56±8.62％，E∶T=20∶1時(shí)LS-effector組對(duì)PaCa-2的殺傷效率高于E∶T=5∶1(P＜0.

12、05)。Ep-effector組對(duì)LS174-T的殺傷效率E∶T=5∶1時(shí)為63.34±1.85％，E∶T=10∶1時(shí)為71.07±8.48％，E∶T=20∶1時(shí)為93.57±5.68％，E∶T=20∶1時(shí)Ep-effector組對(duì)LS174-T的殺傷效率高于E∶T=5∶1(P＜0.05)。Ep-effector組對(duì)PaCa-2的殺傷效率E∶T=5∶1時(shí)為43.40±5.65％，E∶T=10∶1時(shí)為59.42±5.67％，E∶T=20∶

13、1時(shí)為78.37±9.63％, E∶T=20∶1時(shí)Ep-effector組對(duì)PaCa-2的殺傷效率高于E∶T=5∶1（P＜0.05）。
　　5 E∶T=20∶1時(shí)，比較各組效應(yīng)細(xì)胞對(duì)LS174-T及PaCa-2殺傷效率的差異。單純CIK組對(duì)LS174-T的殺傷效率為69.39±6.65％，對(duì)PaCa-2的殺傷效率為66.33±10.04％，兩者比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，LS-effector組對(duì)LS174-T的殺傷效率為7

14、4.71±8.36％，對(duì)PaCa-2的殺傷效率為65.56±8.62％比較，兩者比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。Ep-effector組對(duì)LS174-T的殺傷效率為93.57±5.68％，高于對(duì)PaCa-2的殺傷效率78.37±9.63％(P＜0.05)。
　　6 E∶T=20∶1時(shí)，比較各效應(yīng)細(xì)胞組間對(duì)LS174-T及PaCa-2殺傷效率的差異。單純CIK組對(duì)LS174-T的殺傷效率為69.39±6.65％，LS-effect

15、or組對(duì)LS174-T的殺傷效率為74.71±8.36％，Ep-effector組對(duì)LS174-T的殺傷效率為93.57±5.68％，組間整體殺傷效率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，Ep-effector組高于LS-effector組（P＜0.05），Ep-effector組高于單純CIK組(P＜0.05)，LS-effector組與單純CIK組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。單純CIK組對(duì)PaCa-2的殺傷效率為66.33±10.04％

16、, LS-effector組對(duì)PaCa-2的殺傷效率為65.56±8.62％，Ep-effector組對(duì)PaCa-2的殺傷效率為78.37±9.63％，兩兩組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1 EpCAM抗原表達(dá)于多種腺癌細(xì)胞表面，但表達(dá)量高低不等，在LS174-T細(xì)胞中的表達(dá)量高達(dá)99.95％，EpCAM可能成為L(zhǎng)S174-T腺癌細(xì)胞的免疫治療靶點(diǎn)。
　　2 EpCAM抗原及LS174-T細(xì)胞裂

17、解物負(fù)載imDCs均能夠促其成熟，Ep-mDCs與LS-mDCs均具有抗原提呈能力，分別將EpCAM抗原信息及LS174-T細(xì)胞全抗原信息提呈給自體CIK細(xì)胞，分別促使其向具有EpCAM特異性及LS174-T細(xì)胞全抗原特異性殺傷功能的CTL細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
　　3 PBMCs中的T淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下能夠誘導(dǎo)生成具有免疫殺傷活性的CIK細(xì)胞，LS-mDCs及Ep-mDCs均能夠激活自體CIK細(xì)胞產(chǎn)生具有高效免疫殺傷功能的LS-eff

18、ector及Ep-effector。
　　4單純CIK、LS-effector及Ep-effector對(duì)LS174-T細(xì)胞均具有高效殺傷活性，隨E∶T比值升高，各組殺傷效率均升高，Ep-effector組殺傷效率高于LS-effector組及單純CIK組。單純CIK組對(duì)LS174-T及PaCa-2的殺傷效率相同，Ep-effector對(duì)LS174-T的殺傷效率高于對(duì)PaCa-2的殺傷效率，表明Ep-effector對(duì)EpCAM具有