丁酸鈉對肥胖孕鼠代謝及胰島β細胞功能的影響及其分子機制.pdf

1、隨著飲食習慣及生活方式的改變，肥胖、糖尿病的發(fā)病率逐年攀升。高齡、肥胖孕婦的增多，妊娠期糖尿病（gestational diabetes millus, GDM）的發(fā)病率也不斷增加，GDM產(chǎn)后2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus,T2DM)及子代肥胖發(fā)病率都明顯增加；GDM的發(fā)病與胰島β細胞增殖不足密切相關,研究者已把目光投向了胰島β細胞增殖這一焦點，且認為無論是GDM還是糖尿病患者，尋找可以有效保護修復胰島β細胞

2、，恢復胰島功能，抑制胰島β細胞凋亡的藥物是當今治療糖尿病發(fā)展的重要方向。
　　研究顯示組蛋白去乙?；敢种苿╤istone deacetylase inhibitors, HDACIs）可以改善胰島β細胞功能，促進胰島素釋放與合成；減輕炎癥反應對胰島β細胞的損傷，還可以改善外周組織的胰島素抵抗，調(diào)節(jié)全身免疫對T1DM和T2DM致病的影響。而丁酸鈉(CH3CH2CH2COONa)作為HDACIs一員，存在于抗性淀粉，奶酪等食物中，

3、大腸中的菌群酵解膳食纖維也可合成，合成后立即被結腸細胞作為能量吸收和利用，其能量占到了人體基本能量需求的5-10%，因而受到研究者的廣泛關注。本研究將丁酸鈉添加于肥胖孕鼠飲食中，探討其對代謝及胰島β細胞相關功能及胰島微環(huán)境相關影響。
　　1.肥胖孕鼠模型的建立及丁酸鈉對代謝表型的影響
　　本研究將SPF級4W齡C57BL/6J雌鼠60只適應性喂養(yǎng)一周后，根據(jù)飼料成分不同隨機分為3組分別進行喂養(yǎng)：高脂飼料組（40%脂肪，20%

4、蛋白質(zhì),40%碳水化合物），高脂加丁酸鈉組（95%高脂料+5%丁酸鈉），普通飼料組（14%脂肪，26%蛋白質(zhì)，60%碳水化合物）。測體重每周1次，空腹血糖每兩周1次（禁食12h后斷尾法），喂養(yǎng)至14W，禁食12h球后靜脈叢取血測定空腹胰島素水平，且行腹腔葡萄糖耐量試驗（Intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT）及腹腔胰島素耐量試驗（Intraperitoneal Insulin Tole

5、rance Test, ITGTT）實驗，測定三組小鼠胰島素抵抗情況及對葡萄糖及胰島素的反應性。結果發(fā)現(xiàn)此時高脂組小鼠與其他兩組比較體重出現(xiàn)明顯差異；高脂組空腹血糖偏高，出現(xiàn)明顯的胰島素抵抗；高脂組孕前胰島素水平為1.580±0.23ng/ml，與其他各組比較均有明顯差異(P<0.001)，高脂加丁酸鈉組為0.690±0.120ng/ml與對照組比較有差異(P<0.05)。
　　小鼠休息1W后與雄鼠合籠，結合小鼠的肥胖和妊娠孕14

6、.5d狀態(tài)，此模型是目前最接近人類GDM發(fā)病機理的模型。至孕14.5d，處死后心臟取血，分別分析血清甘油三酯，總膽固醇，胰島素，TNF-α和IL-1β水平，測定丁酸鈉對肥胖孕鼠代謝的影響。結果發(fā)現(xiàn)：至孕14.5d高脂組小鼠平均體重增長了24g,高脂加丁酸鈉組增長了14.8g，對照組增長了11g(各組間P<0.001)。在高脂飲食添加的第10W后小鼠血糖增長較迅速(P<0.001),對照組血糖在整個實驗中波動不明顯，高脂加丁酸鈉組血糖一直

7、高于對照組，卻也低于高脂組(p>0.05)。高脂組的清除葡萄糖的及胰島素刺激下清除葡萄糖的能力在IPGTT及IPITT實驗中各時間點均明顯減低，丁酸鈉顯示了對血糖調(diào)節(jié)能力的改善；高脂組甘油三酯235.21±29.08 mg/dl，而對照組140.45±18.02 mg/dl（P<0.001）；總膽固醇水平：高脂組351.08±59.07 mg/dl；對照組：236.8±41.8 mg/dl(P<0.001)，而高脂加丁酸鈉組甘油三酯僅1

8、76.6±13.92 mg/dl；及總膽固醇244.42±25.17 mg/dl，丁酸鈉明顯降低甘油三酯及總膽固醇水平（P<0.001）；與高脂組相比，丁酸鈉明顯降低外周血IL-1β（P<0.001）及TNF-α水平(P<0.05)。
　　2.丁酸鈉對胰島β細胞胰島素合成及增殖凋亡功能的影響
　　第一部分研究發(fā)現(xiàn)丁酸鈉可改善肥胖孕鼠糖脂代謝，那么為了進一步探討丁酸鈉對胰島β細胞是否有影響，本研究在此肥胖GDM模型基礎上，在胰

9、島質(zhì)量峰值期－－孕14.5d，胰島增殖及抗凋亡高度活躍的狀態(tài)下研究胰島β細胞如何適應這雙重的胰島素抵抗狀態(tài)，丁酸鈉對胰島β細胞增殖及凋亡的影響在這一特殊時期更容易顯現(xiàn)。在孕14.5d，處死孕鼠后迅速分離胰腺組織，一部分OCT中包埋，冰凍切片后-70°C保存，用胰島素抗體標記胰島β細胞，利用免疫熒光組織化學方法測定胰島β胰島素表達及質(zhì)量變化，PCNA及Bcl-2分別作為增殖及抗凋亡的標記分子太探討丁酸鈉對胰島β細胞增殖及抗凋亡功能的影響。

10、使用Image-Pro Plus software軟件測定各組胰島素表達灰度值，同時測定各組胰島β細胞面積，胰島β細胞質(zhì)量，及各組胰島β細胞中PCNA, Bcl-2表達比率。結果發(fā)現(xiàn)：胰島素熒光強度灰度值測定下的結果為對照組0.17±0.03,高脂組0.037±0.007，高脂加丁酸鈉組灰度值為0.09±0.01（P<0.001)。高脂組小鼠的β細胞體積增長最大（112.1±7.18um2）（P<0.001），而高脂加丁酸鈉組及對照組分

11、別為94.5±4.21um2、90.6±6.73 um2,高脂加丁酸鈉組與對照組比較無統(tǒng)計學意義。高脂組小鼠胰島β細胞質(zhì)量2.67±0.17mg,高脂加丁酸鈉組為2.18±0.19 mg，對照組為1.94±0.11 mg，高脂組與另兩組有明顯統(tǒng)計學差異(P<0.001)，高脂加丁酸鈉與對照比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。胰島β細胞的PCNA的陽性比率：高脂組（1.70±0.27）%，高脂加丁酸鈉組（1.45±0.15）%，對照組

12、為（1.4±0.11）%，在對照組及高脂加丁酸鈉組間的結果沒有差異，但高脂組的 PCNA表達水平較高(P<0.05)。另外高脂組抗凋亡因子 Bcl-2的表達水平較另兩組較低（P<0.001），高脂組（1.26±0.49）%，高脂加丁酸鈉組（4.32±0.81）%，對照組為（4.46±0.49）%，同樣Bcl-2水平高脂加丁酸鈉與對照組比較無統(tǒng)計學差異。
　　3.丁酸鈉對胰島β細胞微環(huán)境中炎癥反應及孕鼠仔鼠發(fā)育影響
　　越來越

13、多的研究證實胰島內(nèi)較高的炎癥因子的釋放，影響胰島β細胞的功能及存亡。GDM與胰島炎癥反應也密切相關，它們的病理過程也可以通過抑制炎癥反應得到緩解或治療。丁酸鈉在眾多研究中發(fā)現(xiàn)可以抑制自身免疫性疾病的炎癥反應水平。
　　為進一步探討丁酸鈉改善肥胖孕鼠代謝的機理，在此模型的基礎上我們也選取了部分胰腺組織，同時研究選取了經(jīng)典的NF-κB及其磷酸化NF-κB分子，利用免疫組織化學方法測定其在胰島中的不同表達，探討丁酸鈉對胰島炎癥反應的影響

14、。以上各組在孕14.5d，在處死孕鼠分離的胰腺組織后，第二部分實驗中的另一部分在福爾馬林中固定24h后，石蠟包埋切片，測定三組間胰腺胰島中NF-κB及pNF-κB表達，使用Image-Pro Plus software軟件測定胰島中陽性著色的細胞數(shù)目。結果發(fā)現(xiàn)： NF-κB表達水平高脂組:(6.48±2.39)%，高脂加丁酸鈉組：(2.92±0.73)%，對照組：(0.56±0.15)%，高脂加丁酸鈉組與對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.

15、05)；pNF-κB高脂組:(2.07±0.78)%，高脂加丁酸鈉組:(0.78±0.15)%,對照組:(0.286±0.08), P<0.001)%；高脂加丁酸鈉組胰島中NF-κB及pNF-κB陽性細胞數(shù)目，及pNF-κB/NF-ΚB比值明顯低于高脂組（P<0.001），高脂加丁酸鈉組pNF-κB及pNF-κB/NF-κB與對照組間無統(tǒng)計學差異（p>0.05）。實驗中每組孕鼠都留取3只待其自然分娩，在整個丁酸鈉喂養(yǎng)的周期中，高脂加丁酸

16、鈉組小鼠無一例死亡。14.5d仔鼠未發(fā)現(xiàn)發(fā)育的異常及畸形，母鼠的孕期也無明顯改變。
　　綜上所述，本研究首先建立肥胖孕鼠模型，孕鼠出現(xiàn)明顯的體重差異、糖耐量受損及胰島素抵抗即為GDM建模成功。在此模型的基礎上，系統(tǒng)地研究了丁酸鈉對糖脂代謝的改善,同時發(fā)現(xiàn)其增強胰島β細胞胰島素表達，抑制β細胞凋亡,抑制胰島炎癥反應,同時發(fā)現(xiàn)丁酸鈉對孕鼠及仔鼠無明顯毒性。故丁酸鈉有可能為GDM、及T1DM、T2DM等代謝性疾病的預防及治療開辟嶄新的途