脾細(xì)胞對胰島β細(xì)胞功能影響的體外研究.pdf

1、目的：已有的研究表明，胰島β細(xì)胞功能受多種因素的調(diào)控，以適應(yīng)不同生理及病理狀況下的需求。先后發(fā)現(xiàn)許多因素對胰島β細(xì)胞的功能具有調(diào)節(jié)作用，如營養(yǎng)物質(zhì)、激素和生長因子等。近年來的研究提示脾也是影響胰島β細(xì)胞功能的一個重要因素。有臨床資料分析指出，糖尿病在部分胰腺及脾切除患者比單純部分胰腺切除患者具有更高的發(fā)生率。在不同糖尿病小鼠模型的胰島移植的研究中，表明外源性脾細(xì)胞灌注有助于糖尿病小鼠胰島β細(xì)胞群擴(kuò)大。本研究從細(xì)胞水平觀察脾細(xì)胞對胰島的增

2、殖和胰島素分泌功能的影響；并通過分析胰十二指腸同源盒基因-1（pancreatic and duodenal homeobox-1，PDX-1）的表達(dá)差異，從分子水平探討脾細(xì)胞對胰島β細(xì)胞的功能影響。
　　 方法：采用Dextran密度梯度離心法分離純化SD大鼠胰島，同時分離脾細(xì)胞。實驗分為對照組（單純胰島培養(yǎng)組）、共培養(yǎng)組（胰島與脾細(xì)胞共培養(yǎng)組），分別在Transwell小室系統(tǒng)培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第1、3、5、7天收集胰島，用Ce

3、ll Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒通過酶標(biāo)儀測定吸光度值，了解脾細(xì)胞對胰島增值的影響；用間接放射免疫法測定葡萄糖刺激胰島素的分泌量并計算胰島素刺激指數(shù)（SI），了解脾細(xì)胞對胰島素分泌的影響；用Trizol提取胰島總RNA，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）分別擴(kuò)增PDX-1和β-actin的mRNA，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在UV透射反射分析儀下觀察擴(kuò)增條帶，在凝膠成像系統(tǒng)中成像并分析擴(kuò)增條帶的灰度。PDX-

4、1mRNA的表達(dá)水平以PDX-1與β-actin的灰度比值表示。從而從分子水平探討脾細(xì)胞對胰島功能的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、胰島的分離和純化
　　 大鼠胰腺經(jīng)膠原酶Ⅴ消化和Destran T40純化液純化后，平均每只大鼠可獲得胰島572±78個，純度高達(dá)92％以上。AO/PI染色后，可見絕大部分胰島呈現(xiàn)綠色熒光，活胰島比率大于90％。
　　 2、體外脾細(xì)胞對胰島增值的影響
　　 在培養(yǎng)的第

5、1、3、5、7天，脾細(xì)胞和胰島共培養(yǎng)組中的吸光度值分別是0.214±0.025、0.863±0.045、0.739±0.034和0.654±0.051；單純胰島培養(yǎng)組的吸光度值分別是0.201±0.028、0.423±0.037、0.410±0.031和0.297±0.043。在共培養(yǎng)組第1天的吸光度值與對照組相比，差異不明顯，無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。在共培養(yǎng)組的第3、5、7天的吸光度值分別與對照組相比，具有顯著差異（P<0.01

6、）。
　　 3、體外脾細(xì)胞對胰島素分泌的影響
　　 在葡萄糖刺激胰島素分泌的實驗中，在高糖刺激下，共培養(yǎng)組在培養(yǎng)的第1、3、5、7天的胰島素分泌量（μIU/ml）分別為5.293±0.221、10.925±0.328、8.935±0.415和8.523±0.564；對照組的相應(yīng)胰島素分泌量為5.201±0.218、5.932±0.284、5.378±0.218和5.183±0.237。在培養(yǎng)的第1天，對照組和共培養(yǎng)組的胰

7、島素分泌量無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）；但在培養(yǎng)的第3、5、7天，共培養(yǎng)組的胰島素分泌量與對照組的相比，具有顯著差異（P<0.01），尤其是在培養(yǎng)的第3天。
　　 在培養(yǎng)的第1、3、5、7天，脾細(xì)胞和胰島共培養(yǎng)組中的胰島素的刺激指數(shù)（SI）分別為2.223±0.172、3.418±0.211、3.029±0.308和2.952±0.284；對照組SI分別是2.196±0.164、2.361±0.194、2.084±0.225和1

8、.976±0.209。在培養(yǎng)的第1天，對照組和共培養(yǎng)組的SI相比，無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）；但在培養(yǎng)的第3、5、7天，共培養(yǎng)組的SI與對照組的SI相比，具有顯著差異（P<0.01），尤其是在培養(yǎng)的第3天。
　　 4、體外脾細(xì)胞對胰島的PDX-1基因的表達(dá)
　　 RT-PCR分別擴(kuò)增PDX-1和β-actin mRNA，擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳得到兩個片段，分別為PDX-1（202bp）和β-actin（359bp）

9、。成像結(jié)果分析顯示，在培養(yǎng)的第1、3、5、7天，共培養(yǎng)組的PDX-1和β-actin的灰度比值分別為0.210±0.048，0.711±0.062、0.552±0.058和0.415±0.039；對照組的PDX-1和β-actin的灰度比值分別為0.181±0.057、0.453±0.077、0.261±0.048和0.254±0.027。在培養(yǎng)的第3、5、7天，共培養(yǎng)組的PDX-1和β-actin的灰度比值與對照組相比，具有統(tǒng)計學(xué)差異