AGEs-RAGE信號啟動糖尿病粥樣斑塊鈣化的機制.pdf

1、背景和目的：血管鈣化是糖尿病、動脈粥樣硬化、慢性腎病等多種病理狀態(tài)下，由于高鈣磷環(huán)境以及局部或全身礦化誘導(dǎo)子上調(diào)、抑制子缺失所導(dǎo)致的骨特異性羥基磷灰石結(jié)品[Ca10(OH)2(PO4)6]在成骨樣細(xì)胞介導(dǎo)下主動沉積在血管壁的病理過程。在這一過程中，血管壁礦化防御機制被耗竭，平滑肌細(xì)胞等間葉細(xì)胞丟失原有表型而獲得成骨表型，是多種病理性鈣化發(fā)生的關(guān)鍵所在。故此，尋獲啟動血管壁平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的鈣化級聯(lián)信號及其傳遞路徑一直是鈣化研究領(lǐng)域

2、的關(guān)注焦點。
　　最新資料顯示，我國現(xiàn)有9240萬糖尿病患者和14820萬糖尿病前期患者，已超越印度成為世界第一大糖尿病國家。每年因糖尿病及其并發(fā)癥而造成的直接經(jīng)濟損失高達(dá)260億美元，占全國醫(yī)療費用總支出的18.2％。在糖尿病致死致殘的重要并發(fā)癥中，加速性動脈粥樣硬化以其發(fā)生時間早、進(jìn)展速度快、累及范圍廣、治療預(yù)后籌等特征而倍受醫(yī)學(xué)界重視。基礎(chǔ)實驗與臨床調(diào)查證實，動脈粥樣硬化病理狀態(tài)下大中動脈(尤其是冠狀動脈)的內(nèi)膜鈣化，由于鈣

3、鹽在斑塊內(nèi)異常沉積導(dǎo)致血管壁機械性質(zhì)改變，是造成急性心肌梗死、充血性心力衰竭、血管撕裂、動脈夾層、肢體缺血性壞疽以及經(jīng)皮冠脈介入術(shù)失敗的重要原因。鑒于動脈粥樣硬化內(nèi)膜鈣化的重要臨床意義和糖尿病患病率迅猛增加所帶來的社會負(fù)擔(dān)，深入研究糖尿病動脈粥樣硬化內(nèi)膜鈣化的啟動機制，進(jìn)而有針對性地進(jìn)行約物干預(yù)已經(jīng)尤為迫切。
　　本課題組多年的研究結(jié)果及國內(nèi)外相關(guān)研究均證實，持久的高血糖狀態(tài)可導(dǎo)致糖尿病患者體內(nèi)許多結(jié)構(gòu)和功能蛋白、脂質(zhì)甚至核酸發(fā)生

4、糖基化，經(jīng)過一系列非酶促反應(yīng)最終形成具有高度活性、結(jié)構(gòu)多樣的糖基化終產(chǎn)物(advancedglycationend-products，AGEs)。后者通過與細(xì)胞表面特異性AGEs受體(receptorforAGEs，RAGE)相互作用而發(fā)揮一系列的血管病理作用，加速糖尿病性動脈粥樣硬化及晚期血管鈣化的發(fā)生發(fā)展。但時至今日，有關(guān)AGEs與血管鈣化關(guān)系的研究仍然只是局限于下列兩個方面：單純的對人群現(xiàn)象的觀察和鈣化細(xì)胞模型的研究。AGEs在糖

5、尿病動脈粥樣硬化鈣化發(fā)生發(fā)展及演進(jìn)過程中究竟發(fā)揮了什么樣的作用還有待相關(guān)研究的深入。另有研究顯示，凋亡泡沫細(xì)胞及其繼發(fā)性壞死產(chǎn)生的壞死碎片不僅可為血管壁平滑肌細(xì)胞提供豐富的鈣磷來源，而且還可提供鈣化的成核微環(huán)境。有鑒于此，在本研究中我們借助糖尿病apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化鈣化模型和高脂凋亡共存環(huán)境主動脈平滑肌細(xì)胞鈣化模型兩個平臺來觀察AGEs的主要免疫原-非交聯(lián)非熒光性羧甲基賴氨酸CML對動脈粥樣硬化鈣化進(jìn)展的影響及相關(guān)機制，以期拓

6、展靶向機制的治療策略。
　　方法：本研究分三部分實驗：1.在體研究6周齡apoE-/-小鼠給予腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)40mg/kg/day，連續(xù)5天。2周后血糖水平>300mg/dL的小鼠納入本研究，并由普通飲食轉(zhuǎn)為半合成型高脂飲食(high-fatdiet，HFD)(21％脂肪，0.15％膽同醇，其他成分同普通飲食)，同時給予尾靜脈注射CML10mg/kg/day，連續(xù)四個月。在轉(zhuǎn)換高脂飲食和給予

7、CML注射后的0個月(group0M，n=10)、2個月(group2M，n=10)和四個月(group4M，n=10)時對小鼠實施安樂死，并進(jìn)行相關(guān)檢測與分析。2.巨噬細(xì)胞凋亡研究①高脂環(huán)境下巨噬細(xì)胞分別荷載不同濃度CML48h。選擇能誘導(dǎo)泡洙化和凋亡的最佳濃度。②CML對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)影響的觀察，分為四組：對照組，50μg/mLoxLDL處理組，10μmol/LCML處理組，oxLDLCML聯(lián)合處理組。③觀察何種信號通路介導(dǎo)CM

8、L誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡，分為七組：對照組，oxLDL處理組，oxLDLCML聯(lián)合處理組，anti-RAGE處理組，anti-CHOP處理組，Z-ATAD-FMK處理組，SP600125處理組。3.主動脈平滑肌細(xì)胞鈣化研究①觀察高脂與凋亡共存環(huán)境下不同濃度梯度CML對A7r5主動脈平滑肌細(xì)胞鈣鹽沉積的影響。②觀察高脂與凋亡共存環(huán)境下CML對A7r5主動脈平滑肌細(xì)胞成骨表型的影響。③觀察高脂與凋亡共存環(huán)境下CML經(jīng)過何種信號途徑傳遞鈣化級

9、聯(lián)反應(yīng)，分為六組：對照組，CML處理組，anti-RAGE處理組，DPI處理組，SB203580處理組，anti-cbfα1處理組。④對比CML與高糖在凋亡高脂共存環(huán)境中對鈣化表型的影響。針對上述實驗的觀察內(nèi)容，分別進(jìn)行HE染色、免疫組織化學(xué)染色、免疫細(xì)胞化學(xué)染色、vonKossa染色、Masson染色、鈣含量檢測、ALP活性檢測、TUNEL凋亡分析、annexinV-FITC/PI雙標(biāo)記熒光定性與流式細(xì)胞術(shù)定量凋亡率、膽固醇氧化酶法檢

10、測、油紅O染色、westernblot檢測等相關(guān)分析。
　　結(jié)果：1.病理形態(tài)學(xué)研究證實STZ-CML-HFD聯(lián)合處理2個月糖尿病apoE-/-小鼠可形成早期的動脈粥樣硬化斑塊，處理4個月后主動脈壁形成典型的晚期動脈粥樣硬化斑塊：大的脂質(zhì)池中富含針菱形的膽固醇結(jié)晶，內(nèi)彈力板完整性被破壞，監(jiān)染的膠原纖維明顯增多，在中膜及內(nèi)膜出現(xiàn)廣泛的點灶狀黑色鈣沉積(符合糖尿病動脈粥樣硬化鈣化特點)。而且主動脈壁CML沉積信號和RAGE表達(dá)主要局限

11、于粥樣斑塊內(nèi)。Westernblot跡檢測顯示隨著糖尿病apoE-/-小鼠病程的延長，主動脈壁CML、RAGE、CD36表達(dá)顯著上調(diào)，而膽固醇外流調(diào)控子ABCA1先出現(xiàn)代償性增加繼而義減少至基線附近。油紅O染色定性、膽固醇氧化酶法定量分析發(fā)現(xiàn)CML處理可顯著增加高脂環(huán)境下的RAW264.7巨噬細(xì)胞的膽固醇含量，上調(diào)RAGE、CD36表達(dá)而下調(diào)ABCAl表達(dá)。與動物實驗中血漿LDL增加而HDL降低的結(jié)果一致性地證明CML/RAGE信號可抑

12、制膽固醇逆向轉(zhuǎn)運促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。2.TUNEL染色與cleavedcaspase-3免疫組化染色發(fā)現(xiàn)隨著糖尿病動脈粥樣硬化的演進(jìn)斑塊內(nèi)細(xì)胞凋亡率增加明顯，annexinV-FITC/PI雙標(biāo)記熒光定性與流式細(xì)胞術(shù)定量分析以及cleavedcaspase-3免疫細(xì)胞化學(xué)顯示CML能增加巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的早期和晚期凋亡率，并可呈劑量依賴性的方式上調(diào)細(xì)胞總的凋亡率。免疫組織化學(xué)定位分析顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶分子GRP78、CHOP主要分布

13、在動脈粥樣硬化病變區(qū)的脂質(zhì)池內(nèi)，而且相對于CHOP，4M組GRP78的分布位置似乎更傾向于脂質(zhì)池的基底部。半定量westernblot分析發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)GRP78、磷酸化PERK、磷酸化eIF2α、ATF4和CHOP的表達(dá)隨著動物實驗時間的延長均呈上調(diào)趨勢。在巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的檢測中上述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)均可被糖基化終末產(chǎn)物CML所誘導(dǎo)和活化。經(jīng)中和性抗體或特異性抑制劑阻斷相關(guān)信號傳遞節(jié)點后發(fā)現(xiàn)CML誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

14、性凋亡主要經(jīng)CHOP傳遞，而caspase-12只是介導(dǎo)了一部分未經(jīng)RAGE傳遞的凋亡信號。3.在STZ-CML-HFD聯(lián)合處理的糖尿病動脈粥樣硬化apoE-/-小鼠主動脈壁平滑肌細(xì)胞固有表型SM22a逐漸丟失，而成骨表型BMP-2、cbfα1、ALP的表達(dá)與活性則增加。進(jìn)一步細(xì)胞學(xué)水平的研究顯示高脂與凋亡共存環(huán)境下糖基化終末產(chǎn)物CML顯著增加A7r5主動脈平滑肌細(xì)胞間的鈣沉積，成骨表型與平滑肌細(xì)胞矧有表型的變化與動物實驗相一致。隨后的

15、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷性實驗證實了CML/RAGE→NADPHoxidase→ROS→p38MAPK→cbfa1→ALP鈣化級聯(lián)信號的傳遞途徑。另外，高糖實驗發(fā)現(xiàn)是CML而非高糖誘導(dǎo)了主動脈壁平滑肌細(xì)胞鈣化表型的出現(xiàn)。
　　結(jié)論：1.STZ-CML-HFD聯(lián)合干預(yù)四個月可成功誘導(dǎo)apoE-/-小鼠形成糖尿病動脈粥樣硬化鈣化。2.首次在高脂與凋亡共存環(huán)境中利用糖基化終末產(chǎn)物CML成功構(gòu)建了一個全新的鈣化模型。3.在巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞CML通