cyclin G1在小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的表達(dá)及調(diào)控.pdf

1、細(xì)胞周期(cell cycle)與多種人類疾病相關(guān)，其中最重要的是與腫瘤的關(guān)系。細(xì)胞周期的調(diào)控是一系列正負(fù)調(diào)節(jié)因子相互作用的結(jié)果，其中最關(guān)鍵的調(diào)控因子包括周期蛋白依賴性激酶(CDKs)及細(xì)胞周期蛋白(cyclin)等。細(xì)胞周期素(cyclin)是在調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程中發(fā)揮重要作用的一類特殊蛋白質(zhì)。迄今為止，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少有16種細(xì)胞周期素，其作用于細(xì)胞周期的各個(gè)時(shí)期，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖分化過(guò)程。 cyclin G1是

2、發(fā)現(xiàn)較晚的一種細(xì)胞周期素，在骨骼肌、卵巢及腎中表達(dá)水平較高。目前對(duì)cyclin G1的確切功能尚未完全認(rèn)識(shí)。一方面，cyclinG1作為p53的靶基因，能被野生型p53轉(zhuǎn)錄激活，提示cyclin G1在細(xì)胞周期中可能作為負(fù)調(diào)節(jié)因子，參與DNA損傷后G2／M期的阻滯、DNA的損傷修復(fù)及細(xì)胞調(diào)亡等過(guò)程。另一方面，cyclin G1在細(xì)胞周期中又可作為正調(diào)節(jié)因子，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。cyclin G1在不同的組織具有不同的生物活性，推測(cè)可能與其

3、表達(dá)水平有關(guān)。 1996年，Mary C.Horne發(fā)現(xiàn)cyclin G1在卵巢中高表達(dá)。但cyclin G1在卵巢中表達(dá)的細(xì)胞定位，cyclin G1是否參與了顆粒細(xì)胞的增殖分化過(guò)程以及cyclin G1表達(dá)水平是否受垂體促性腺激素的調(diào)控等未見詳細(xì)報(bào)道。鑒于顆粒細(xì)胞在卵泡發(fā)育過(guò)程中發(fā)生的一系列形態(tài)功能變化以及cyclin G1在其它組織細(xì)胞中的作用，本課題將研究cyclin G1在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)是否受FSH與hCG/LH的調(diào)

4、節(jié)，進(jìn)一步闡明cyclin G1在顆粒細(xì)胞增殖分化過(guò)程的作用。性成熟小鼠經(jīng)腹腔注射孕馬血清促性腺激素(PMSG)，48h后取其雙側(cè)卵巢并分離顆粒細(xì)胞，于無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行體外培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后分別加入外源性促性腺激素FSH和hCG作用12h后，采用半定量RT-PCR、細(xì)胞免疫組化、western blot等方法從mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中cyclin Gl表達(dá)以及FSH和hCG對(duì)cyclin G1表達(dá)水平的影響，以期進(jìn)一

5、步闡明cyclin G1在顆粒細(xì)胞增殖分化調(diào)控過(guò)程中的作用。 半定量RT-PCR：收集細(xì)胞后，用Trizol提取顆粒細(xì)胞總RNA，采用一步反應(yīng)法進(jìn)行RNA擴(kuò)增，以廣泛存在于細(xì)胞中的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)對(duì)照，以小鼠骨骼肌RNA作為陽(yáng)性對(duì)照，分別測(cè)定cyclinG1和GAPDH條帶的光密度值，并以二者的光密度比值(cyclin G1/GAPDH比值)代表cylin G1 mRNA的表達(dá)水平。顆粒細(xì)胞的免疫組織化

6、學(xué)染色：直接于24孔板中進(jìn)行細(xì)胞染色，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，染色步驟按照SP法免疫組化操作方法進(jìn)行。western blot：收集細(xì)胞后加入細(xì)胞裂解液，按照常規(guī)方法提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)樣品處理液處理并煮沸后用于western b1ot檢測(cè)，并以β-actin作為內(nèi)對(duì)照檢測(cè)各樣品上樣量是否一致，顯影后所得X光片掃描各條帶的灰度值，以cyclin G1條帶與β-actin條帶灰度值的比值表示cyclin G1蛋白的表達(dá)水平，從而從蛋白

7、質(zhì)水平檢測(cè)顆粒細(xì)胞cyclin G1的表達(dá)。 結(jié)果顯示，外源性FSH和hCG作用12h后，hCG組cyclin G1 mRNA表達(dá)水平均明顯降低(0．0825±O.00707，n=10)，與對(duì)照組(0.2040±O.00482，n=10)及FSH組(0.2050±0.00748，n=10)相比均有顯著性差異(p<0.01)：FSH組cyclin G1 mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比無(wú)明顯區(qū)別(p>0.05)。western blo

8、t結(jié)果顯示，hCG可明顯降低cyclin Gl蛋白的表達(dá)水平(2.4270±0.09823，n=10)，與對(duì)照組 (3.7263±0.00874，n=10)和FSH組(3.6533±0.1150，n=10)相比有顯著性差異(p<0.01)，而FSH組cyclin G1蛋白的表達(dá)水平變化不明顯，與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(p>0.05);細(xì)胞免疫組化染色也得到了同樣的結(jié)果。 綜上所述，小鼠卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)有cyclin G1表