小鼠卵丘顆粒細(xì)胞-卵子復(fù)合物脂類代謝及基因調(diào)控.pdf

1、第一章:正常小鼠圍排卵期卵丘顆粒細(xì)胞-卵子復(fù)合物(COC)脂質(zhì)存在狀態(tài)
　　 目的：系統(tǒng)性描述生理狀態(tài)下圍排卵期小鼠卵巢組織中的脂質(zhì)存在狀態(tài)；COC內(nèi)脂滴相關(guān)蛋白表達(dá)；COC內(nèi)脂滴含量動(dòng)態(tài)變化及脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)差異。
　　 內(nèi)容與方法：
　　 1.免疫組織化學(xué)方法檢測圍排卵期卵巢組織中載脂蛋白Apo—A1及Apo—B,定性細(xì)胞外脂質(zhì)存在狀態(tài)；
　　 2.免疫熒光染色共定位載脂蛋白Apo—B與卵丘顆粒細(xì)

2、胞骨架蛋白-透明質(zhì)酸酶結(jié)合蛋白(HABP),定位細(xì)胞外脂質(zhì)分布；
　　 3.使用兩類親脂性染料-BODIPY及Nile Red,定性及半定量測定COC內(nèi)脂質(zhì)含量及分布動(dòng)態(tài)變化；
　　 4.免疫組織化學(xué)檢測PAT及CIDE兩大類脂質(zhì)相關(guān)蛋白家族成員在卵巢組織中表達(dá)；
　　 5.免疫熒光共定位ADRP及脂滴在COC中表達(dá),半定量COC內(nèi)ADRP蛋白表達(dá),Realtime-PCR測定COC內(nèi)ADRP基因表達(dá)；
　

3、　 6.Taqman Array96一well plate IP/N4415461)檢測小鼠未成熟及成熟COC內(nèi)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)(44個(gè))。
　　 結(jié)果：
　　 1.Apo—A1及Apo—B在小鼠卵巢組織中的免疫組織化學(xué)染色揭示在排卵周期中脂蛋白存在于卵子及其周圍顆粒細(xì)胞中。在排卵hCG刺激之前低水平表達(dá),而排卵刺激6h之后在卵泡竇腔內(nèi)表達(dá)大量的增加,接近排卵時(shí)(hCG后12h)達(dá)到最高峰值。排卵之后仍可在輸卵管內(nèi)

4、檢測到載脂蛋白包裹在卵子周圍；
　　 2.Apo-B在卵泡竇腔內(nèi)持續(xù)表達(dá),hCG刺激后呈現(xiàn)增加趨勢；HABP在排卵hCG刺激后出現(xiàn)。Apo—B與HABP表達(dá)共定位表明載脂蛋白錨定于卵丘顆粒細(xì)胞骨架蛋白之上,為卵丘顆粒細(xì)胞的生長、擴(kuò)張、植入過程提供脂質(zhì)能量來源,進(jìn)而為卵子的成熟、受精、卵裂提供能量成為可能；
　　 3.兩類特異性親脂熒光染料對小鼠圍排卵期COC內(nèi)脂滴表達(dá)進(jìn)行定位,半定量分析表明兩種染色結(jié)果類似。脂滴存在于排

5、卵前后的小鼠卵子以及卵丘顆粒細(xì)胞的胞漿內(nèi)。脂滴在未成熟的小鼠卵子內(nèi)均勻分布,而在hCG峰后,脂滴轉(zhuǎn)化成為大的塊狀顆粒,聚集于卵胞漿內(nèi)。脂滴的半定量分析得出,排卵峰出現(xiàn)后小鼠卵子體積縮小脂滴重新分布,呈團(tuán)塊狀聚集于胞漿內(nèi),脂質(zhì)含量增加；
　　 4.免疫組織化學(xué)檢測PAT及CIDE兩大類脂質(zhì)相關(guān)蛋白家族表達(dá)。在整個(gè)圍排卵期的卵巢組織內(nèi),ADRP廣泛分布于卵泡膜細(xì)胞、壁層顆粒細(xì)胞、卵丘顆粒細(xì)胞,以及分布于從次級卵泡至竇腔卵泡之間的所有

6、卵子內(nèi)。hCG刺激之前,ADRP均質(zhì)分布于卵子內(nèi),隨著排卵峰值出現(xiàn),ADRP聚集呈點(diǎn)狀,散在分布。Perilipin在卵泡膜細(xì)胞中持續(xù)高表達(dá),在卵泡壁層顆粒細(xì)胞及COC中的表達(dá)相對較低,排卵峰值的刺激對其表達(dá)量無明顯影響。CIDE-A及CIDE-B均表達(dá)于卵巢組織內(nèi),在較小的次級卵泡中表達(dá)量較高,隨著卵泡生長,其表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢；
　　 5.ADRP與BODIPY在COC內(nèi)呈現(xiàn)共定位表達(dá),而且與光鏡下卵子內(nèi)脂滴黑色顆粒位置一致

7、。表明ADRP即為COC內(nèi)的脂滴包裹蛋白。ADRP蛋白及mRNA表達(dá)在排卵后均顯著增加；
　　 6.所檢小鼠COC測脂質(zhì)代謝相關(guān)基因共44個(gè)。在成熟過程中36個(gè)脂類代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因表達(dá)發(fā)生顯著變化。由于成熟后小鼠COC較未成熟COC內(nèi)含有顯著增加的細(xì)胞內(nèi)脂滴含量,因此甘油三酯、膽固醇、脂肪酸等合成關(guān)鍵酶類的基因表達(dá)降低,細(xì)胞攝取受體減少,線粒體酶活性降低,而磷脂分解代謝增強(qiáng),其下游產(chǎn)物如各類前列腺素、血栓烷A類、白介素及炎

8、癥性細(xì)胞因子等合成基因表達(dá)增強(qiáng)。而已有研究表明這些炎癥介質(zhì)對于正常的卵子成熟及排卵過程具有重要作用。PPARgamma基因作為細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝調(diào)控基因,在小鼠COC中也起到重要的作用,所檢測的44個(gè)基因多數(shù)已證明為PPAR調(diào)控基因,由此而得出假設(shè):PPARgamma可能是小鼠COC內(nèi)各類脂質(zhì)代謝的總調(diào)控者,在小鼠COC成熟過程中綜合調(diào)控各類基因表達(dá)以使COC具有充足的甘油三酯為COC排卵及后續(xù)受精提供能量儲(chǔ)備,多量的磷脂提供受精后的卵裂過

9、程所需的細(xì)胞膜,同時(shí)磷脂的各類代謝產(chǎn)物也是正常卵子發(fā)育及排卵過程的保障,而多量的游離膽固醇則是各種類固醇激素合成的前體物質(zhì)。
　　 結(jié)論：
　　 1.載脂蛋白Apo—A1以及Apo—B均表達(dá)于小鼠圍排卵期卵巢組織內(nèi),結(jié)合于卵丘顆粒細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白,包裹在卵子周圍,其表達(dá)量在靠近排卵時(shí)尤為增高,是卵子生長過程細(xì)胞外脂質(zhì)供應(yīng)來源；
　　 2.小鼠圍排卵期卵子及顆粒細(xì)胞中存在著細(xì)胞內(nèi)脂滴儲(chǔ)備。脂滴呈均質(zhì)分布于卵胞漿內(nèi),而在

10、排卵峰出現(xiàn)后,伴隨著GVBD以及第一極體的排出,胞漿結(jié)構(gòu)重塑,脂滴分布模式發(fā)生動(dòng)態(tài)變化,大量的脂滴形成大顆粒狀,聚集于卵子中央,同時(shí)伴隨卵子體積縮小；
　　 3.ADRP蛋白在圍排卵期卵巢組織中的表達(dá)呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化,在未成熟卵子內(nèi)呈均質(zhì)表達(dá),逐漸變成為成熟卵子中點(diǎn)狀聚集,散在分布。成熟COC內(nèi)ADRP蛋白及mRNA表達(dá)量增加。ADRP是COC內(nèi)包裹脂滴的調(diào)節(jié)蛋白。Perilipin在卵泡膜細(xì)胞中特異高表達(dá),推斷其在卵巢組織中的作用

11、類似于在其他類固醇激素分泌的細(xì)胞(如腎上腺皮質(zhì),leydig細(xì)胞等),調(diào)節(jié)卵巢組織內(nèi)類固醇激素類的合成、分泌。CIDE家族的表達(dá)隨著卵泡發(fā)育周期表達(dá)量降低,其中的作用機(jī)制尚不明確；
　　 4.脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)相關(guān)基因差異表達(dá)揭示,PPARgamma作為小鼠COC內(nèi)脂類代謝總調(diào)控基因,促使COC在成熟過程中大量儲(chǔ)集甘油三酯、游離膽固醇及脂肪酸。為排卵、受精及卵裂過程及類固醇激素合成提供重要的能量來源及合成前體。各種脂類的攝取、合成、代

12、謝及釋放通路相互配合協(xié)調(diào),呈動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。
　　 第二章:高脂飲食對小鼠圍排卵期卵丘顆粒細(xì)胞-卵子復(fù)合物脂質(zhì)代謝及細(xì)胞器功能影響
　　 目的：揭示高脂飲食對小鼠圍排卵期COC內(nèi)脂質(zhì)含量及脂質(zhì)相關(guān)蛋白表達(dá)影響；明確增加的脂肪含量所誘導(dǎo)的細(xì)胞脂毒性反應(yīng)(線粒體內(nèi)膜電位,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,細(xì)胞凋亡)的發(fā)生；檢測高脂飲食對COC內(nèi)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)影響。
　　 內(nèi)容與方法：
　　 1.肥胖小鼠模型建立:5周齡CBA小

13、鼠以21％脂肪的高脂飲食(High Fat Diet,HFD)或?qū)φ诊嬍?control Diet,CD)飼養(yǎng)4周。稱量體重,取血清檢測血糖、胰島素、甘油三酯及膽固醇水平；
　　 2.特異性親脂性染料BODIPY對飲食干預(yù)后HFD組和CD組COC內(nèi)脂質(zhì)含量半定量分析；
　　 3.免疫組織化學(xué)檢測HFD組與CD組卵巢組織內(nèi)ADRP表達(dá)量,Real—time PCR檢測該基因表達(dá)狀況；
　　 4.HFD組及CD組CO

14、C內(nèi)線粒體內(nèi)膜電位JC-1染色；
　　 5.Real-time PCR檢測兩組COC及壁層顆粒細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因(GRP78,ATF4以及CHOP10)表達(dá)；
　　 6.壁層顆粒細(xì)胞DNA碎片ladder,180bp及360bp條帶強(qiáng)度半定量；
　　 7.卵巢組織TUNEL染色,凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)算凋亡指數(shù);
　　 8.Taqman Array96-well plate(P/N4415461)檢測高脂飲食組

15、與對照飲食組小鼠成熟COC內(nèi)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)差異(44個(gè))。
　　 結(jié)果：
　　 1.4周高脂飲食后小鼠體重增加2g,血清學(xué)檢測表明小鼠具有高脂蛋白血癥及高血糖癥;
　　 2.4周飲食干預(yù)后,HFD組未成熟卵子內(nèi)脂肪含量較CD組明顯增加,而hOG刺激之后的脂肪含量出現(xiàn)更進(jìn)一步的顯著增加(P<0.0001)。飲食干預(yù)直接增加卵巢內(nèi)生長發(fā)育成熟過程中的卵子內(nèi)脂肪含量,卵子體積增大(P=0.045)；
　　

16、 3.COC中JC-1染色測定線粒體內(nèi)膜電位,明確了HFD對小鼠卵子胞漿內(nèi)線粒體損傷作用。在對照組卵子中,高膜電位線粒體出現(xiàn)在卵泡漿周邊區(qū)域(紅色),而較低電位的線粒體分布于卵泡漿中央?yún)^(qū)域(綠色)。在高脂飲食小鼠卵子中,周邊區(qū)域的紅色熒光強(qiáng)度減弱,較廣泛地分布于卵泡漿內(nèi)。而綠色熒光呈現(xiàn)增加趨勢聚集于卵胞漿內(nèi)(線粒體損傷最早即表現(xiàn)為線粒體膜極性下降,紅色及綠色熒光比例代表細(xì)胞內(nèi)的膜極性狀態(tài),該比值的減少是線粒體損傷的標(biāo)志)。對照組未成熟小

17、鼠卵子JC-1染色后紅/綠熒光強(qiáng)度比值為0.82±0.04,成熟后比值降低為0.61±0.06(P=0.01)。高脂飼料喂養(yǎng)四周后,成熟及未成熟卵子紅色/綠色熒光比值均減少,未成熟卵子比值為0.59±0.05(P=0.002),成熟卵子比值為0.38±0.05(P=0.01)；
　　 4.為了明確高脂飲食對小鼠卵子胞漿中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的影響,分別測定了COC以及壁層顆粒細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因的表達(dá)量,包括GRP78、ATF4以及CHO

18、P10。(GRP78是最常用的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的生物學(xué)標(biāo)志；ATF4蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)節(jié)unfolded protein response反應(yīng)中數(shù)種基因的啟動(dòng)子；cHOP10是另外一種ER應(yīng)激的反應(yīng)蛋白)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高脂飲食促使小鼠COC中GRP78和ATF4基因表達(dá)增加,顆粒細(xì)胞的GRP78表達(dá)也增加。CHOP10表達(dá)量未受到飲食干預(yù)影響,在兩組中的表達(dá)量相當(dāng)；
　　 5.檢測小鼠卵巢組織中顆粒細(xì)胞及COC內(nèi)的細(xì)胞凋亡狀態(tài)。DNA

19、 ladder分析顯示顆粒細(xì)胞內(nèi)180bp及360bp細(xì)胞條帶強(qiáng)度較對照組增加,表明DNA破碎程度增加。卵巢組織切片TUNEL染色顯示HFD卵巢組織中顯著增加的TUNEL陽性染色細(xì)胞。HFD組凋亡指數(shù)在COC中為44.03‰,壁層顆粒細(xì)胞中為31.83‰；正常飲食小鼠COC中凋亡指數(shù)為7.6‰,壁層顆粒細(xì)胞中為7.65‰(P<0.001)；
　　 6.脂類代謝相關(guān)基因檢測表明,高脂飲食在多方面影響COC內(nèi)脂質(zhì)代謝。包括長鏈不飽和

20、脂肪酸生成、膽固醇生成、磷脂代謝、白介素、細(xì)胞因子生成以及線粒體代謝酶類。這些異常的代謝途徑均可能是進(jìn)一步影響卵子質(zhì)量的關(guān)鍵因素。
　　 結(jié)論：
　　 1.使用4周HFD方法建立小鼠肥胖模型,小鼠體重顯著增加2g(P<0.01)。各項(xiàng)脂類代謝內(nèi)分泌指標(biāo)表明小鼠出現(xiàn)高脂血癥傾向,類似于肥胖人群,肥胖模型建立成功；
　　 2.4周HFD可顯著促進(jìn)小鼠未成熟及成熟COC內(nèi)脂滴募集,脂肪含量增加；
　　 3.4周

21、HFD促使小鼠卵子內(nèi)線粒體膜電位降低,顯示小鼠卵子線粒體損傷；
　　 4.HFD可促使小鼠COC及壁層顆粒細(xì)胞內(nèi)ER stress基因表達(dá)增強(qiáng)；
　　 5.脂類囤積,ERstress,線粒體損傷等脂毒性反應(yīng)可最終導(dǎo)致細(xì)胞DNA碎裂,加劇HFD小鼠COC細(xì)胞凋亡過程；
　　 6.HFD顯著影響COC內(nèi)正常脂質(zhì)代謝基因的平衡狀態(tài),由此可最終影響卵子質(zhì)量。
　　 第三章異常的內(nèi)分泌環(huán)境對體外培養(yǎng)未成熟小鼠卵子脂

22、質(zhì)代謝影響
　　 目的：評估兩類最常用的體外培養(yǎng)體系對小鼠卵子體外成熟過程脂類募集影響；肥胖患者卵泡液,正常體重患者卵泡液對小鼠體外成熟COC脂肪含量脂蛋白基因表達(dá)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因表達(dá)影響；模擬異常內(nèi)分泌的體外培養(yǎng)環(huán)境(高胰島素,高雄激素,不同長度碳鏈脂肪酸)對體外成熟小鼠卵子內(nèi)脂肪含量影響。
　　 內(nèi)容與方法：
　　 1.采用最常用的體外培養(yǎng)成熟系統(tǒng):基于3mg/ml無自由脂肪酸的牛血清白蛋白(Bovine s

23、erum albumin,BSA)或基于5％胎牛血清(Fetal calf serum,FCS),體外成熟COC行脂肪染色及卵子成熟度評估；
　　 2.50％體積比添加人類卵泡液用于小鼠COC體外培養(yǎng)成熟。行脂肪染色及卵子成熟度評估:Real—time PCR用于半定量COC內(nèi)ADRP及ER應(yīng)激基因表達(dá)；luminax檢測卵泡液中載脂蛋白及慢性炎癥因子水平；
　　 3.小鼠未成熟卵子體外培養(yǎng):胰島素濃度梯度0μg/ml,

24、0.052μg/ml,0.26μg/ml,1.3μg/ml,6.9μg/ml。睪酮濃度梯度0nmol/L,200nmol/L,1000nmol/L、及5000nmol/L。各類脂肪酸濃度50nmol/L。行脂肪染色及卵子成熟度評估。
　　 結(jié)果：
　　 1.體外培養(yǎng)成熟系統(tǒng)中添加生長因子(EGF及FSH)可顯著促進(jìn)COC內(nèi)脂滴募集,5％FCS培養(yǎng)環(huán)境可進(jìn)一步促進(jìn)COC脂滴含量增加。BSA內(nèi)培養(yǎng)成熟卵子內(nèi)脂肪含量與在體成熟

25、卵子水平一致,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　 2.雖然肥胖患者及對照患者卵泡液均未影響小鼠COC的卵丘顆粒細(xì)胞擴(kuò)張,但肥胖組卵泡液含有顯著增加的炎癥性細(xì)胞因子IL-6,IL-10,Leptin及載脂蛋白AⅠ,AⅡ,可顯著增加卵子內(nèi)脂肪含量,阻斷小鼠卵子第一極體排出過程,卵子成熟率明顯降低,同時(shí)伴有COC內(nèi)ER應(yīng)激基因表達(dá)增強(qiáng)。正?；颊呗雅菀鹤鳛樾∈驝OC體外培養(yǎng)環(huán)境,對COC內(nèi)脂滴含量及ADRP基因表達(dá)影響與在體成熟COC一致;

26、>　　 3.胰島素:依據(jù)生理狀態(tài)下卵泡液內(nèi)胰島素濃度水平制定濃度梯度,體外培養(yǎng)添加外源性的胰島素并未影響COC擴(kuò)張或卵子第一極體排出過程,COC內(nèi)脂肪含量測定亦未發(fā)現(xiàn)各濃度對于卵子內(nèi)脂肪含量影響；睪酮:濃度大于1000nmol/L睪酮明顯阻礙卵子生殖泡降解過程及第一極體排出,卵丘顆粒細(xì)胞擴(kuò)張程度受抑制,卵子成熟過程受到阻礙導(dǎo)致該組卵子內(nèi)脂肪含量相應(yīng)減少；不同長度碳鏈脂肪酸:實(shí)驗(yàn)選用碳鏈長度介于8至18的飽和脂肪酸,以及C18單不飽和脂

27、肪酸。用于比較不同長度碳鏈脂肪酸及脂肪酸飽和程度對于卵子內(nèi)脂肪含量影響。結(jié)果表明卵子對于不同碳鏈長度脂肪酸的攝取具有選擇性。長度為16碳的Palmitic較其他脂肪酸更顯著性促進(jìn)卵子內(nèi)的脂滴募集,不飽和脂肪酸并未明顯增加卵子內(nèi)脂滴含量。
　　 結(jié)論：
　　 1.比較BSA及FCS兩類最常用的體外培養(yǎng)成熟系統(tǒng)對于維持小鼠卵子正常脂肪動(dòng)態(tài)變化方面的優(yōu)劣,BSA內(nèi)成熟卵子內(nèi)脂滴含量與在體成熟卵子較一致,而FCS則顯著促進(jìn)了卵子

28、內(nèi)脂滴的募集過程；
　　 2.患者卵泡液內(nèi)甘油三酯(TG),脂肪酸(FFA)及亞急性炎癥因子水平為機(jī)體內(nèi)分泌環(huán)境的直接反映。肥胖患者卵泡液內(nèi)顯著增加的TG,FFA,載脂蛋白A及炎癥細(xì)胞因子(IL-6,IL-10及l(fā)eptin)可顯著抑制體外培養(yǎng)成熟的小鼠卵子第一極體排出,影響卵子成熟；同時(shí)卵子內(nèi)脂肪含量及ADRP表達(dá)顯著增加伴有ER應(yīng)激基因的表達(dá)增強(qiáng)；
　　 3.外源性添加胰島素未發(fā)現(xiàn)對小鼠卵子內(nèi)脂肪含量影響；濃度大于1