miR-133b對(duì)人卵丘顆粒細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、目的:
　　我國(guó)不孕癥發(fā)病率7％～10%，并有逐年上升的趨勢(shì)。在不孕癥的諸多病因中，卵泡發(fā)育和成熟障礙是女性不孕癥常見(jiàn)的類型，卵丘顆粒細(xì)胞是成熟卵泡中最大的細(xì)胞群。研究miR-133b在卵丘顆粒細(xì)胞中的表達(dá)及其作用機(jī)制，對(duì)于探明調(diào)控卵泡發(fā)育成熟分子機(jī)制，尋找影響卵泡生長(zhǎng)發(fā)育新的藥物靶點(diǎn)，為防治女性不孕癥及相關(guān)的內(nèi)分泌疾病提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　收集2015年05月至2015年09月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖

2、中心進(jìn)行卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（ICSI）治療的女性不孕患者的卵丘顆粒細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。
　?。?）光學(xué)顯微鏡和CCK-8法觀察人卵丘顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中的生長(zhǎng)情況。
　?。?）Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)人卵丘顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中 miR-133b、cleaved caspase3及TAGLN2的表達(dá)。
　　（3）將miR-133b轉(zhuǎn)染至人卵丘顆粒細(xì)胞中，采用CCK-8法、流式細(xì)胞儀技術(shù)和Western b

3、lot技術(shù)檢測(cè)miR-133b對(duì)人卵丘顆粒細(xì)胞增殖、凋亡及周期的影響。
　?。?）將miR-133b轉(zhuǎn)染至人卵丘顆粒細(xì)胞中，采用Western blot和Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)miR-133b對(duì)人卵丘顆粒細(xì)胞中TAGLN2表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果:
　?。?）光學(xué)顯微鏡和CCK-8顯示，人卵丘顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)4～6h后細(xì)胞開(kāi)始貼壁，24h貼壁率達(dá)96%，第2～3天增殖迅速，細(xì)胞間以絲狀突起相互連接，第4天

4、后細(xì)胞逐漸退化凋亡。
　?。?） Real-time PCR顯示人卵丘顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中，第2～4天miR-133b的mRNA水平逐漸升高（P?0.01），而cleaved caspase3和TAGLN2的mRNA水平逐漸降低（P?0.01）；第4天后miR-133b的mRNA水平不斷降低（P?0.01），則cleaved caspase3的mRNA水平不斷升高（P?0.05）， TAGLN2的mRNA水平于第6天后也不斷升高

5、（P?0.01）。
　?。?）按0nM、50nM、100 nM濃度和24h、48h、72h、96h時(shí)間梯度將miR-133b mimic、inhibitor及對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至人卵丘顆粒細(xì)胞中。CCK-8顯示， miR-133b mimic轉(zhuǎn)染24h、48、72h后，顆粒細(xì)胞數(shù)顯著增多（P?0.05）；而miR-133b inhibitor抑制人卵丘顆粒細(xì)胞的增殖（P?0.05）。流式細(xì)胞儀顯示，與對(duì)照組相比，miR-133b

6、mimic促使G0/G1期細(xì)胞進(jìn)入S和G2期，細(xì)胞凋亡率顯著降低（P?0.05）；miR-133b inhibitor使細(xì)胞阻滯于G0/G1期，但細(xì)胞凋亡結(jié)果無(wú)顯著差異。Western blot顯示miR-133b mimic顯著下調(diào)cleaved caspase3蛋白質(zhì)水平（P?0.01），上調(diào)pro-caspase3蛋白質(zhì)水平，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P?0.05）；miR-133b inhibitor顯著上調(diào) cleaved casp

7、ase3蛋白質(zhì)水平（P?0.05），顯著下調(diào)pro-caspase3蛋白質(zhì)水平（P?0.01）。
　?。?）Real-time PCR和Western blot顯示在人卵丘顆粒細(xì)胞中， miR-133b mimic在mRNA和蛋白質(zhì)水平可顯著下調(diào)TAGLN2的表達(dá)（P<0.05）；miR-133b inhibitor在mRNA和蛋白質(zhì)水平可顯著上調(diào)TAGLN2的表達(dá)（P<0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、人卵丘顆粒細(xì)胞