大黃蟅蟲(chóng)丸和自主神經(jīng)功能對(duì)肝纖維化卵圓細(xì)胞生成的調(diào)控研究.pdf

1、研究目的: 在不影響慢性肝纖維化病程自然發(fā)展前提下，分別阻斷支配大鼠肝臟的交感神經(jīng)（sympathetic nerve）、迷走神經(jīng)（vagus nerve）以降低自主神經(jīng)系統(tǒng)（autonomic nervous system）的活性，觀察自主神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)肝卵圓細(xì)胞（hepatic oval cell，HOC）活化的調(diào)控作用。根據(jù)HOC活化細(xì)胞數(shù)同肝纖維化發(fā)展程度病理分級(jí)的關(guān)系，探討HOC在慢性肝纖維化病程中所起的確切作用，為以HO

2、C為靶細(xì)胞的治療開(kāi)拓思路。觀察大黃蟅蟲(chóng)丸對(duì)慢性肝纖維化大鼠模型HOC的活化作用，了解其在治療肝纖維化中的科學(xué)意義，為中醫(yī)藥治療肝纖維化提供依據(jù)。 研究方法: 1.動(dòng)物分組：取雄性Wistar大鼠96只，體重180±20g，每組12只，隨機(jī)分為8組，分別為：HOC活化抑制組（迷走神經(jīng)肝支切斷），HOC活化增強(qiáng)組（化學(xué)性肝交感神經(jīng)阻斷），肝纖維化模型假手術(shù)組，肝纖維化模型組，大黃蟅蟲(chóng)丸高劑量組（按成人5倍劑量），大黃蟅蟲(chóng)丸中

3、劑量組（按成人2.5倍劑量），大黃蠊蟲(chóng)丸常規(guī)劑量組（按成人等效劑量），空白對(duì)照組。各組給予普通飲食，自由飲水。 2.預(yù)處理：HOC活化抑制組行迷走神經(jīng)肝支切斷術(shù)；HOC活化增強(qiáng)組以6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）建立肝臟去交感神經(jīng)動(dòng)物模型，具體方法：6-OHDA臨用時(shí)用滅菌生理鹽水配制成100ml/L的溶液。Wistar大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定于大鼠手術(shù)板上，腹部剪毛，局部消毒，于腹

4、部正中縱行切開(kāi)一長(zhǎng)3cm切口，用鑷子輕輕夾出小腸，理出空腸段系膜，找到腸系膜血管，用4號(hào)半頭皮針刺入腸系膜主干靜脈中，并同時(shí)注入2ml6-OHDA（含200μg）。用棉簽壓迫針眼約8～10min，待針孔出血停止，將小腸還納腹腔，逐層縫合腹壁，常規(guī)飼養(yǎng)；肝纖維化模型假手術(shù)組則于造模前行腹腔切開(kāi)，隨后手術(shù)縫合，術(shù)后常規(guī)護(hù)理。此三組處理均在肝纖維化造模前15天進(jìn)行以盡量減少對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。 3.肝纖維化模型的制作：除空白對(duì)照組外，其

5、余各組以二甲基亞硝胺（N-Nitrosodimethylamine，DMN）10mg·kg-1劑量大鼠腹腔注射，每周連續(xù)3天，每日1次，共4周。干預(yù)方法：大黃蟅蟲(chóng)丸高、中、常規(guī)劑量組在造模第一天開(kāi)始中藥干預(yù)。大鼠每日灌胃劑量：大黃蟅蟲(chóng)丸高、中、常規(guī)劑量組分別含生藥3.0g/kg、1.5g/kg、0.6g/kg；其余各組以等量生理鹽水灌胃作為對(duì)照。 4.血清檢測(cè)：于造模開(kāi)始后第29日，大鼠以10%水合氯醛（3ml/kg）ip麻醉后

6、，仰臥位固定，打開(kāi)腹腔，腹主動(dòng)脈采血，離心獲取血清。用放射免疫RIA法檢測(cè)血清透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）、Ⅲ型前膠原（typeⅢprocollagen，PcⅢ）、層粘連蛋白（Laminin，LN）血清濃度變化。 5.肝組織的采集與處理：腹主動(dòng)脈采血后，脫頸椎處死大鼠。取0.3～0.4cm厚肝組織，40g/L中性甲醛液固定，24 h后逐級(jí)酒精脫水，二甲苯透明，56℃石蠟包埋，6μm厚切片，用于免疫組化染色。取

7、1.0cm×0.8cm×0.3cm大小肝組織，40g/L中性甲醛液固定，24h后逐級(jí)酒精脫水，二甲苯透明，56℃石蠟包埋，4μm厚切片，用于Mallory染色。取50～100mg肝組織放入Trizol中，置入超低溫冰箱保存，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。 6.肝纖維化程度鑒定：應(yīng)用Mallory三步染色法判斷各組膠原纖維增生程度。判定標(biāo)準(zhǔn)：0期，正常肝臟，無(wú)明顯膠原纖維增生；Ⅰ期，膠原纖維增生，中央靜脈和門脈區(qū)有少量星狀膠原纖維束

8、放散，但無(wú)間隔形成；Ⅱ期，膠原纖維增生，中央靜脈和門脈區(qū)結(jié)締組織變厚，由此向四周伸出纖維索，形成不完全間隔；Ⅲ期，膠原纖維大量增生，有個(gè)別菲薄的完全間隔形成，或較厚的不完全間隔即將形成假小葉；Ⅳ期，形成的完全間隔較厚，假小葉大量形成。 7.卵圓細(xì)胞的鑒定與計(jì)數(shù)：采用免疫組織化學(xué)染色，以O(shè)V-6作為HOC標(biāo)志物。免疫組織化學(xué)樣本制備采用兩步法：大鼠肝組織切片脫蠟至水，PBS沖洗、浸泡5分鐘，高壓熱抗原修復(fù)，3% H2O2室溫室溫孵

9、育5～10分鐘，加抗大鼠OV-6抗體（1：100稀釋）孵育，置入濕盒中，4℃過(guò)夜；PBS沖洗，滴加二抗；PBS沖洗，加二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色5～30分鐘。蘇木精液復(fù)染細(xì)胞核1分鐘；自來(lái)水沖洗，鹽酸酒精分色1～2次；自來(lái)水泡洗5分鐘；切片脫水、透明；中性樹(shù)膠封片。PBS替代一抗作為空白對(duì)照染色。取肝組織免疫組化切片，光鏡下（10×10）觀察OV-6陽(yáng)性染色細(xì)胞的分布，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)不同視野，在4

10、0×10放大倍數(shù)下，應(yīng)用IPP6.0軟件對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞染色面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以5個(gè)不同視野面積計(jì)數(shù)的平均值為每張切片的計(jì)數(shù)值。 8.統(tǒng)計(jì)方法：所有數(shù)據(jù)處理采用SPSS13.0軟件完成，數(shù)據(jù)均以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。HOC活化抑制組、HOC活化增強(qiáng)組、肝纖維化模型假手術(shù)組、肝纖維化模型組、空白對(duì)照組間HOC細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較，大黃蟅蟲(chóng)丸高、中、常規(guī)劑量組、肝纖維化組模型組、空白對(duì)照組對(duì)HOC活化的影響結(jié)果以及各組間血清學(xué)指標(biāo)的比較，以及

11、各組TIMP-1 mRNA、CTGF mRNA、Notch1 mRNA的差異表達(dá)均采用單向方差分析，組間比較如方差齊采用LSD法，方差不齊則采用Dunnett’s T3法；各組間肝纖維化病理分期的比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)之Kruskal Wallis檢驗(yàn)。HOC增生與肝纖維化的相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析法。 結(jié)果: 一、自主神經(jīng)系統(tǒng)及大黃蟅蟲(chóng)丸對(duì)肝纖維化病理分期的影響 二、自主神經(jīng)系統(tǒng)及大黃蟅蟲(chóng)丸對(duì)血清HA的

12、影響 三、自主神經(jīng)系統(tǒng)及大黃蟅蟲(chóng)丸對(duì)血清PCⅢ的影響 四、自主神經(jīng)系統(tǒng)及大黃蟅蟲(chóng)丸對(duì)血清LN的影響 五、自主神經(jīng)系統(tǒng)及大黃蟅蟲(chóng)丸對(duì)肝纖維化模型大鼠HOC增殖的影響 六、HOC活化增殖與肝纖維分級(jí)的相關(guān)性分析 七、自主神經(jīng)系統(tǒng)及大黃蟅蟲(chóng)丸對(duì)肝纖維化模型大鼠TIMP-1 mRNA、CTGFmRNA、Notch1 mRNA表達(dá)的影響 結(jié)論: 一、交感神經(jīng)系統(tǒng)（sympathetic ne

13、rvous system，SNS）抑制劑（SNSIs）可以顯著降低DMN肝纖維化大鼠纖維化程度，保護(hù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝損傷；迷走神經(jīng)阻斷則加重DMN大鼠纖維化、損傷程度。 二、SNSIs通過(guò)SNS對(duì)肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）和HOC的直接調(diào)節(jié)影響對(duì)損傷肝臟的修復(fù)；推測(cè)大鼠的肝臟祖細(xì)胞可能表達(dá)M3型受體，迷走神經(jīng)肝支通過(guò)乙酰膽堿（ACh）結(jié)合M3型受體刺激了卵圓細(xì)胞的激活。 三、大黃蟅蟲(chóng)丸抗纖

14、維化機(jī)制之一是抑制了TIMP-1的活性，降低了與MMPs的結(jié)合，使MMPs對(duì)ECM的降解作用增強(qiáng)；大黃蟅蟲(chóng)丸可以抑制HSC的增殖，促進(jìn)MMPs對(duì)ECM的降解，體現(xiàn)了其“化瘀”的作用。 四、大黃蟅蟲(chóng)丸抗纖維化的機(jī)制與下調(diào)纖維化病程中過(guò)度表達(dá)的CTGFmRNA有關(guān)。CTGF被抑制，其促ECM合成的作用減弱，有利于ECM降解，是“化瘀”的另一種體現(xiàn)；其表達(dá)細(xì)胞黏附因子的作用減弱，使細(xì)胞不易黏附和結(jié)合基質(zhì)蛋白，脫離纖維趨化環(huán)境，此即中醫(yī)