RNAi沉默多發(fā)性骨髓瘤DKK1基因?qū)Τ晒羌毎只挠绊?pdf

1、目的：
　　 通過實驗證實多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266表達DKK1,其上清液能夠抑制鼠成骨祖細胞MC3T3E1的成骨分化過程,并通過RNAi致DKK1基因沉默,DKK1表達下降,從而減輕對小鼠成骨祖細胞MC3T3-E1成骨分化的抑制,初步探討DKK1在骨髓瘤骨病(MBD)發(fā)病中的作用。
　　 方法：
　　 1.RT-PCR方法測定多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266在mRNA水平上是否表達DKK1,采用Western blo

2、t方法檢測多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266上清液中是否存在可溶性的DKK1。
　　 2.將重組質(zhì)粒pLenti6/V5-Gw/DKK-1-miR,與慢病毒包裝質(zhì)粒一起經(jīng)脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染293FT細胞,48h后收獲細胞上清液獲得慢病毒,高速離心濃縮后感染骨髓瘤細胞株U266,經(jīng)Blasticidin篩選后得到DKK1基因長期沉默的U266細胞株,RT-PCR檢測胞漿DKK1 mRNA表達和Western blot法檢測濃縮50倍的細胞

3、上清液中DKK1蛋白的表達來分析DKK1 RNAi的效率。
　　 3.將U266原細胞株、DKK1 RNAi U266細胞株和無關(guān)序列RNAi的U266細胞株等3種細胞培養(yǎng)上清液以30％濃度的量分別加入BMP-2誘導(dǎo)MC3T3-E1成骨祖細胞分化體系中,12天后觀察3者對MC3T3-E1細胞成骨分化的影響,觀察指標為MC3T3-E1細胞堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OC)和核心結(jié)合因子1(Cbfa-1)的mRNA水平,堿性磷酸酶

4、(ALP)染色結(jié)節(jié)計數(shù)和鈣結(jié)節(jié)計數(shù)。
　　 結(jié)果：
　　 1.慢病毒高速離心濃縮15倍后感染NIH3T3細胞,48h表達增強型綠色熒光蛋白(EmGFP),流式細胞術(shù)檢測NIH3T3細胞EmGFP表達率計算出慢病毒濃縮液滴度為4.27×105TU/ml；
　　 2.采用半定量RT-PCR法可檢測到骨髓瘤細胞株U266表達較高的DKK1 mRNA,并且在骨髓瘤細胞株U266上清液中以Western blot法可檢測到

5、可溶性DKK1蛋白。結(jié)果證實在U266細胞株中存在DKK-1的表達。
　　 3.我們觀察加入30％U266上清至鼠成骨誘導(dǎo)體系中12天后,觀察到成骨分化明顯抑制,ALP、Cbfa-1、OCmRNA表達,鈣結(jié)節(jié)計數(shù),ALP結(jié)節(jié)計數(shù)明顯降低。(ALP結(jié)節(jié)及鈣結(jié)節(jié)計數(shù)及P<0.001,mRNA均P<0.05)。
　　 4.與普通U266細胞比較,DKK1 RNAi U266細胞的DKK1表達量有明顯減少(P<0.001),抑制

6、率達50％以上。且經(jīng)過多次凍存、傳代后,再次檢測相關(guān)指標發(fā)現(xiàn)DKK1仍被穩(wěn)定抑制。
　　 5.我們看到30％DKK1 RNAi U266上清干預(yù)組與30％U266上清干預(yù)組比較,ALP、Cbfa-1、OC表達,鈣結(jié)節(jié)計數(shù),ALP結(jié)節(jié)計數(shù)明顯升高(ALP結(jié)節(jié)和mRNA P<0.05,鈣結(jié)節(jié)計數(shù)P<0.01),而與誘導(dǎo)組比較,ALP、Cbfa-1、OC表達,鈣結(jié)節(jié)計數(shù),ALP結(jié)節(jié)計數(shù)變化不明顯(P>0.05)。30％無關(guān)序列shRN

7、A U266上清干預(yù)組與30％U266上清干預(yù)組比較,ALP、Cbfa-1、OC表達,鈣結(jié)節(jié)計數(shù),ALP結(jié)節(jié)計數(shù)無明顯差別(P>0.05),30％無關(guān)序列shRNA U266上清干預(yù)組與30％DKK1 shRNA U266上清干預(yù)組比較,ALP、Cbfa-1、OC表達,鈣結(jié)節(jié)計數(shù),ALP結(jié)節(jié)計數(shù)有所降低(ALP、OC,P<0.01；Cbfa-1,P<0.05,ALP結(jié)節(jié)計數(shù)P<0.001,鈣結(jié)節(jié)計數(shù)P<0.001)。
　　 結(jié)論