幽門螺桿菌ureI核酸疫苗的構(gòu)建及其免疫活性初步研究.pdf

1、目的：構(gòu)建幽門螺桿菌尿素通道蛋白UreI的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/ureI，并在HeLa細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。通過肌肉注射免疫C57BL/6小鼠，觀察其所產(chǎn)生的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，為研制高效、新型的幽門螺桿菌核酸疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：用PRIMER5.0軟件設(shè)計引物， PCR擴(kuò)增ureI基因，將該基因酶切插入pcDNA3.1(+)真核細(xì)胞表達(dá)載體構(gòu)建 pcDNA3.1(+)/ureI重組載體,并轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)

2、胞，用Western-blot觀察鑒定其在真核細(xì)胞得到表達(dá)后，將核酸疫苗pcDNA3.1(+)/ureI、對照空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)及PBS分組通過肌肉注射免疫6w齡C57BL/6小鼠，隔周免疫一次，共免疫四次。 ELISA間接法測定小鼠血清中特異性IgG抗體水平，ELISA雙抗體夾心法檢測脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-4水平，MTT比色法檢測脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，免疫熒光組化法檢測ureI在小鼠肌肉組織中的表達(dá)情況，通過P

3、CR法檢測小鼠肌細(xì)胞中ureI基因的存在。
　　結(jié)果：
　　(1)成功構(gòu)建了pcDNA3.1(+)/ureI真核表達(dá)載體，且重組質(zhì)粒能在HeLa細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)目的蛋白,且免疫熒光組化法檢測ureI在小鼠肌肉組織中能夠有效表達(dá)。
　　(2)小鼠接種pcDNA3.1(+)/ureI核酸疫苗后能產(chǎn)生特異性IgG抗體，10w后ELISA測定血清抗體A450值為1.249，效價為1:2048。
　　(3)核酸疫苗pcDNA

4、3.1(+)/ureI免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)特異性抗原刺激后，培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-4含量明顯升高[分別為(275.20±43.21)pg/mL，(436.5±68.97) pg/mL)]，與空質(zhì)粒組[分別為(18.30±5.32)pg/mL，(40.10±18.54)pg/mL]之間差異具有顯著性(P<0.01)。
　　(4)脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)測定：pcDNA3.1(+)/ureI核酸疫苗組小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)特異性抗原刺激后

5、，刺激指數(shù)(1.76±0.16)明顯高于空質(zhì)粒組(1.20±0.14)和PBS組(1.14±0.12)(P<0.01)。
　　(5)PCR檢測ureI基因可在小鼠肌細(xì)胞中存在。
　　結(jié)論：
　　(1)成功構(gòu)建了pcDNA3.1(+)/ureI真核表達(dá)載體且其能在真核細(xì)胞中表達(dá)。
　　(2) pcDNA3.1(+)/ureI核酸疫苗能刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。
　　(3) pcDNA3.1(