幽門螺桿菌BabA2-UreI融合基因減毒傷寒沙門氏菌重組活載體疫苗的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、背景與目的：幽門螺桿菌(Helicobactcr pylori，Hp)的高感染率及其嚴(yán)重的危害性，使Hp疫苗成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)之一。隨著疫苗研究的深入，應(yīng)用混合抗原成分制備Hp疫苗將是未來(lái)Hp疫苗研究的趨勢(shì)。細(xì)胞內(nèi)感染性細(xì)菌減毒后作為DNA疫苗載體是目前基因疫苗研究的熱點(diǎn)之一。沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)是一種較為常見(jiàn)的侵襲性胞內(nèi)菌，通過(guò)基因工程方法減毒后對(duì)宿主致病性顯著降低，但仍保留良好的侵襲力，可直接將表達(dá)

2、質(zhì)粒攜帶進(jìn)入動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)相應(yīng)的蛋白而誘導(dǎo)特異性的免疫應(yīng)答反應(yīng)。但由于其質(zhì)粒中含有抗生素抗性基因，盡管其在體外試驗(yàn)有效，在人體內(nèi)卻無(wú)法應(yīng)用，Nakayama等構(gòu)建的平衡致死系統(tǒng)解決了這一問(wèn)題。本課題擬構(gòu)建幽門螺桿菌BabA2/UreI融合基因雙價(jià)DNA疫苗，首先通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建含asd基因的重組原核表達(dá)質(zhì)粒，并利用沙門氏菌asd平衡致死系統(tǒng)，最終獲得表達(dá)重組人BabA2/UreI融合基因蛋白的重組沙門菌減毒疫苗株x8501(pYA3

3、342/BabA2/UreI)，并檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)和抗原性，為制備預(yù)防Up感染的DNA疫苗奠定基礎(chǔ)。 方法： ①BabA2/UreI融合基因的克?。阂詐cDNA3.1(-)/BabA2/UreI融合基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增BabA2/UreI融合基因，PCR產(chǎn)物連接到pCF-T載體上，用TSS法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，用氨芐青霉素和藍(lán)白篩選法挑選T-A克隆，并測(cè)序。擴(kuò)增含有BabA2/UreI融合基因的大腸

4、桿菌DH5α，提取質(zhì)粒，用SmaⅠ和SaⅡ酶切質(zhì)粒，獲得高濃度的融合基因。 ②構(gòu)建原核表達(dá)載體：SmaⅠ和SaⅡ雙酶切asd的組成型表達(dá)的原核表達(dá)載體pYA3342，將編碼BabA2/UreI的融合基因插入pYA3342，構(gòu)建pYA3342/BabA2/UreI重組質(zhì)粒；TSS法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌x6212，篩選重組子；測(cè)序和酶切鑒定。 ③轉(zhuǎn)化減毒傷寒沙門氏菌x8501株構(gòu)建活載體疫苗株：采用缺失天門冬氨酸-β-半醛脫氫酶(

5、Δasd)的傷寒沙門氏菌x8501作為載體菌，將pYA3342/BabA2/UreI重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入減毒傷寒沙門氏菌x8501，構(gòu)建表達(dá)BabA2/UreI融合基因平衡致死的減毒傷寒沙門重組菌x8501(pYA3342/BabA2/UreI)，，提取質(zhì)粒，酶切和PCR擴(kuò)增鑒定。 ④目的基因mRNA測(cè)定：RT-PCR檢測(cè)x8501(pYA3342/BabA2/UreI)mRNA的表達(dá)。 ⑤重組蛋白抗原性檢測(cè)：分別提取培養(yǎng)上

6、清和細(xì)菌蛋白，SDS-PAGE分離重組蛋白，以兔抗Hp的多克隆抗體為一抗，用Western Blot法檢測(cè)重組蛋白的抗原性。 ⑥重組疫苗穩(wěn)定性檢測(cè)：重組菌x8501(pYA3342/BabA2/UreI)在體外連續(xù)培養(yǎng)5天后，提取質(zhì)粒，檢測(cè)穩(wěn)定性。 結(jié)果： ①利用PCR技術(shù)從pcDNA3.1(-)/BabA2/UreI中擴(kuò)增出了BabA2/UreI融合基因，瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)大小與預(yù)計(jì)一致，并成功構(gòu)建了BabA2

7、/UreI的重組質(zhì)粒pCF-T/BabA2/UreI。測(cè)序結(jié)果證實(shí)BabA2/UreI融合基因正確插入到pCF-T載體中。 ②成功構(gòu)建了pYA3342/BabA2/UreI重組質(zhì)粒，測(cè)序分析顯示所得序列完整，插入的基因片段全長(zhǎng)2860bp，與基因文庫(kù)中的BabA2和UreI基因的同源性分別達(dá)100％和97％。 ③成功構(gòu)建了表達(dá)BabA2/UreI的減毒傷寒沙門菌重組菌株x8501(pYA3342/BabA2/UreI)；

8、酶切和PCR擴(kuò)增鑒定證實(shí)重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入x8501。 ④RT-PCR結(jié)果顯示融合基因能有效轉(zhuǎn)錄。 ⑤免疫印跡顯示減毒傷寒沙門重組菌x8501(pYA3342/BabA2/UreI)可以表達(dá)融合蛋白BabA2/UreI，并能夠被兔抗Hp的多克隆抗體識(shí)別，分子量大約是106KDa，并可以呈現(xiàn)分泌性表達(dá)。 ⑥重組質(zhì)粒能穩(wěn)定存在于宿主菌，并無(wú)丟失。 結(jié)論： ①成功構(gòu)建pYA3342/BabA2/UreI重