制備可控制性大鼠膠質(zhì)瘤活疫苗的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文制備可控制性大鼠膠質(zhì)瘤活疫苗的實(shí)驗(yàn)研究姓名：林健申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：外科學(xué) 神經(jīng)外科學(xué)指導(dǎo)教師：徐如祥;王偉民20070526中文摘要較，細(xì)胞因子分泌量顯著減∥“”J 。人類I 型單純皰疹病毒胸苷激酶( h e r p e ss i m p l e x v i r a l t h y m i d i n e k i n a s e ,H S V - T K ) 基因是當(dāng)前研究和臨床應(yīng)用最多的一種自殺基因，T

2、K 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞對抗病毒藥物羥甲基無環(huán)鳥苷一更昔洛韋( g a n c i c l o v i r , G C V ) 可產(chǎn)生高度敏感性而被殺傷【3 刪。這種H S V - T K ／G C V 系統(tǒng)，1 9 9 3 年在我國進(jìn)行的中國單皰病毒T K 基因治療腦膠質(zhì)瘤的試驗(yàn)研究中得到進(jìn)一步證實(shí)( 國家自然科學(xué)基金3 9 3 7 0 6 8 8 ) 。我們于2 0 0 0 年就提出利用T K 基因作為可控制因素的“腦膠質(zhì)瘤活疫苗的

3、實(shí)驗(yàn)研究”，已經(jīng)獲得廣東省自然科學(xué)基金( o o l l 2 2 ) 和全軍醫(yī)學(xué)科研“十五”計劃項(xiàng)目基金( 0 1 M A 0 3 8 ) 的資助。我們設(shè)計，將大鼠I L - 1 2 基因和T K 基因共同修飾膠質(zhì)瘤9 L 細(xì)胞，并與樹突狀細(xì)胞( D c ) 融合，制備D C ／9 L ／r l L - 1 2 - T K 雜交瘤苗。利用該活瘤苗接種宿主，疫苗接種后一段時間，體內(nèi)再給予G C V 滅活瘤苗，形成既可控制瘤苗體內(nèi)增殖，又可

4、調(diào)控r I L - 1 2 分泌的活瘤苗。該疫苗可最大限度地發(fā)揮I L - 1 2 的抗腫瘤免疫效應(yīng)，再者，I ) C 可將膠質(zhì)瘤細(xì)胞共同的相關(guān)抗原有效遞呈，可以多克隆刺激宿主產(chǎn)生特異性抗膠質(zhì)瘤免疫反應(yīng)。本論文的研究內(nèi)容為該課題中建立基因修飾腫瘤細(xì)胞疫苗部分，將為后續(xù)的研究作準(zhǔn)備。本研究通過構(gòu)建大鼠r l L - 1 2 基因真核表達(dá)質(zhì)粒，先建立d L - 1 2 基因修飾的大鼠膠質(zhì)瘤9 L ／r l L - 1 2 細(xì)胞株。再通過構(gòu)建

5、T K 基因慢病毒載體表達(dá)質(zhì)粒和建立T K 基因表達(dá)的慢病毒包裝系統(tǒng)，利用攜帶T K 基因的慢病毒感染9 L ／r I L l 2 細(xì)胞，分步驟制備r l L - 1 2 基因和T K 基因共同修飾、并穩(wěn)定表達(dá)的大鼠9 L ／r l L - 1 2 ．T K膠質(zhì)瘤細(xì)胞疫苗，同時驗(yàn)證了H S V - T K ／G C V 系統(tǒng)在體外控制9 L ，r I L ．1 2 m 【瘤苗細(xì)胞增殖的作用。I L - 1 2 是由2 個不相關(guān)的亞基因p

6、 4 0 和p 3 5 編碼的4 0 k D 重鏈和3 5 k D 輕鏈，經(jīng)二硫鍵相連而成的異二聚體細(xì)胞因子1 4 7 , 4 8 ] ，在轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞時，p 4 0 和p 3 5必須同時等量表達(dá)才能產(chǎn)生有效的生物學(xué)活性的I L _ 1 2 1 4 9 , 5 0 ] 。在論文第一章中，我們通過提取W i s t a r 大鼠腹腔巨噬細(xì)胞，經(jīng)脂多糖( L P S ) 刺激體外培養(yǎng)后再提取細(xì)胞總R N A ，用R T - P C R

7、方法獲取d L - 1 2 的p 4 0 、p 3 5 兩個亞基的e D N A 。運(yùn)用分子克隆技術(shù)，依次將p 4 0 、p 3 5 的c D N A 插入p e D N A 3 ．1 ( ．) ／m y c - H i s A 質(zhì)粒中，以I R E S 連接雙亞基，構(gòu)建成雙順反子真核表達(dá)載體質(zhì)粒p c D N A 3 ．1 ／r I L - 1 2 。構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)過酶切、P C R 及D N A 測序等鑒定正確，為建立r l L