大鼠增殖抑制基因?qū)Υ笫竽z質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　研究腺病毒介導(dǎo)的大鼠增殖抑制基因(rat hyperplasia suppressor gene, rHSG)在大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞(C6)中的表達(dá)及其對大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探討其作用的機(jī)制。
　　方法：
　　1、體外培養(yǎng)大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞(C6細(xì)胞)，用攜帶有rHSG基因的重組腺病毒載體(Adv-rHSG-GFP)轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞。根據(jù)MOI將細(xì)胞分為：A組MOI=0、B組MOI=10、C組MOI=50、

2、D組MOI=80、E組MOI=100，轉(zhuǎn)染Adv-rHSG-GFP24h后分別收集每組細(xì)胞，采用Western Blot和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測rHSG蛋白的表達(dá)，并通過流式細(xì)胞儀和倒置熒光顯微鏡觀察GFP陽性表達(dá)來評價(jià)重組腺病毒載體的轉(zhuǎn)染效率。用MOI為100的Adv-rHSG-GFP轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞不同時(shí)間后(12h,24h,36h,48h)，同法收集細(xì)胞并檢測rHSG蛋白的表達(dá)及評價(jià)重組腺病毒載體的轉(zhuǎn)染效率。
　　2、C6細(xì)胞分為未

3、轉(zhuǎn)染組、Adv-GFP轉(zhuǎn)染組和Adv-rHSG-GFP轉(zhuǎn)染組，采用Western blot法和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測rHSG蛋白的表達(dá)；使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，并結(jié)合MTT、細(xì)胞計(jì)數(shù)法和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察rHSG對細(xì)胞增殖的影響；應(yīng)用Western blot法檢測增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)和細(xì)胞周期調(diào)控蛋白p27Kip1、p21Cip1的蛋白表達(dá)變化；
　　

4、3、通過Hoechst33342/PI雙染法和彗星實(shí)驗(yàn)觀察C6細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征以及rHSG對細(xì)胞凋亡的影響；采用Western blot法檢測過表達(dá)rHSG后PARP和cleaved caspase-3蛋白水平變化以及檢測過表達(dá)rHSG對胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor，IGF-1)誘導(dǎo)的PI3K/Akt和MAPK信號通路的影響。
　　結(jié)果：
　　1、Adv-rHSG-GFP轉(zhuǎn)染

5、C6細(xì)胞24h后，rHSG蛋白的相對表達(dá)量和綠色熒光蛋白表達(dá)隨MOI值的增高而增多；用MOI為100的Adv-rHSG-GFP轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞后，12h即可觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，且在24h內(nèi)隨時(shí)間的變化而增高，在24-36h綠色熒光蛋白表達(dá)無變化，48h有所降低(P﹤0.01)；rHS G蛋白相對表達(dá)量在12-48h內(nèi)隨時(shí)間的變化而增高，于48h達(dá)到最大值(P﹤0.01)。
　　2、Adv-rHSG-GFP轉(zhuǎn)染組C6細(xì)胞中：rHS

6、G蛋白的能夠高效表達(dá)且相對表達(dá)量均明顯高于未轉(zhuǎn)染組和Adv-GFP轉(zhuǎn)染組(P<0.01)；流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1期，且MTT、細(xì)胞計(jì)數(shù)和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖受到明顯抑制(P<0.01)；周期調(diào)控蛋白p27Kip1、p21Cip1表達(dá)升高，PCNA表達(dá)降低。
　　3、通過Hoechst33342/PI雙染法和彗星實(shí)驗(yàn)觀察到rHSG可以促進(jìn)C6細(xì)胞凋亡和DNA損傷；Western blot法

7、檢測結(jié)果顯示過表達(dá)rHSG后Full-length PARP于24h、72h和96h表達(dá)量明顯升高(P<0.01)，而在48h明顯降低(P<0.01)；cleaved PARP和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.01)，并能夠顯著抑制IGF-1誘導(dǎo)的Akt和Erk1/2蛋白活化，且rHSG對p-Erk1/2的抑制強(qiáng)于對p-Akt的抑制。
　　結(jié)論：
　　1、攜帶有rHSG基因的重組腺病毒載體能夠有