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文檔簡介
1、目的:
研究腺病毒介導的大鼠增殖抑制基因(rat hyperplasia suppressor gene, rHSG)在大鼠膠質(zhì)瘤細胞(C6)中的表達及其對大鼠膠質(zhì)瘤細胞增殖和凋亡的影響,并探討其作用的機制。
方法:
1、體外培養(yǎng)大鼠膠質(zhì)瘤細胞(C6細胞),用攜帶有rHSG基因的重組腺病毒載體(Adv-rHSG-GFP)轉(zhuǎn)染C6細胞。根據(jù)MOI將細胞分為:A組MOI=0、B組MOI=10、C組MOI=50、
2、D組MOI=80、E組MOI=100,轉(zhuǎn)染Adv-rHSG-GFP24h后分別收集每組細胞,采用Western Blot和免疫細胞化學法檢測rHSG蛋白的表達,并通過流式細胞儀和倒置熒光顯微鏡觀察GFP陽性表達來評價重組腺病毒載體的轉(zhuǎn)染效率。用MOI為100的Adv-rHSG-GFP轉(zhuǎn)染C6細胞不同時間后(12h,24h,36h,48h),同法收集細胞并檢測rHSG蛋白的表達及評價重組腺病毒載體的轉(zhuǎn)染效率。
2、C6細胞分為未
3、轉(zhuǎn)染組、Adv-GFP轉(zhuǎn)染組和Adv-rHSG-GFP轉(zhuǎn)染組,采用Western blot法和免疫細胞化學法檢測rHSG蛋白的表達;使用流式細胞儀分析細胞周期,并結(jié)合MTT、細胞計數(shù)法和平板克隆形成實驗觀察rHSG對細胞增殖的影響;應用Western blot法檢測增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)和細胞周期調(diào)控蛋白p27Kip1、p21Cip1的蛋白表達變化;
4、3、通過Hoechst33342/PI雙染法和彗星實驗觀察C6細胞凋亡的形態(tài)學特征以及rHSG對細胞凋亡的影響;采用Western blot法檢測過表達rHSG后PARP和cleaved caspase-3蛋白水平變化以及檢測過表達rHSG對胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor,IGF-1)誘導的PI3K/Akt和MAPK信號通路的影響。
結(jié)果:
1、Adv-rHSG-GFP轉(zhuǎn)染
5、C6細胞24h后,rHSG蛋白的相對表達量和綠色熒光蛋白表達隨MOI值的增高而增多;用MOI為100的Adv-rHSG-GFP轉(zhuǎn)染C6細胞后,12h即可觀察到綠色熒光蛋白的表達,且在24h內(nèi)隨時間的變化而增高,在24-36h綠色熒光蛋白表達無變化,48h有所降低(P﹤0.01);rHS G蛋白相對表達量在12-48h內(nèi)隨時間的變化而增高,于48h達到最大值(P﹤0.01)。
2、Adv-rHSG-GFP轉(zhuǎn)染組C6細胞中:rHS
6、G蛋白的能夠高效表達且相對表達量均明顯高于未轉(zhuǎn)染組和Adv-GFP轉(zhuǎn)染組(P<0.01);流式細胞儀分析結(jié)果表明細胞周期被阻滯在G0/G1期,且MTT、細胞計數(shù)和平板克隆形成實驗顯示大鼠膠質(zhì)瘤細胞增殖受到明顯抑制(P<0.01);周期調(diào)控蛋白p27Kip1、p21Cip1表達升高,PCNA表達降低。
3、通過Hoechst33342/PI雙染法和彗星實驗觀察到rHSG可以促進C6細胞凋亡和DNA損傷;Western blot法
7、檢測結(jié)果顯示過表達rHSG后Full-length PARP于24h、72h和96h表達量明顯升高(P<0.01),而在48h明顯降低(P<0.01);cleaved PARP和cleaved caspase-3蛋白表達量明顯升高(P<0.01),并能夠顯著抑制IGF-1誘導的Akt和Erk1/2蛋白活化,且rHSG對p-Erk1/2的抑制強于對p-Akt的抑制。
結(jié)論:
1、攜帶有rHSG基因的重組腺病毒載體能夠有
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