參與腦缺血損傷和保護(hù)機(jī)制的蛋白靶點(diǎn)篩查.pdf

1、第一軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文參與腦缺血損傷和保護(hù)機(jī)制的蛋白靶點(diǎn)篩查姓名：陳亮申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：神經(jīng)生物學(xué)指導(dǎo)教師：高天明20070520摘要立的；作用對(duì)象也是廣泛的，包括了神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和血管元件；在亞細(xì)胞水平上，它們涉及線(xiàn)粒體、核、細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體等多個(gè)細(xì)胞器已知一些蛋白分子(包括離子通道、線(xiàn)粒體呼吸鏈成分、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子)的表達(dá)變化參與甚至決定了這些機(jī)制的進(jìn)行。在以上這些主要已知的細(xì)胞死亡途徑中，線(xiàn)粒體是已知最重要的

2、細(xì)胞器之一。線(xiàn)粒體包含了一系列促凋亡因子，包括細(xì)胞色素C、繼發(fā)性線(xiàn)粒體源性caspase激活因子(secondarymitochondrialactivatorofcaspase。Smac／Diablo)、核酸內(nèi)切酶、A腰等，線(xiàn)粒體上轉(zhuǎn)運(yùn)孔道的形成，氧化磷酸化相關(guān)成分的變化都是線(xiàn)粒體成為關(guān)鍵細(xì)胞器的原因。為了找到新的參與細(xì)胞損傷或者保護(hù)機(jī)制的線(xiàn)粒體組分，本研究在短暫性全腦缺血神經(jīng)元遲發(fā)性死亡模型上，提取純化線(xiàn)粒體后選擇觀(guān)察了缺血前后線(xiàn)粒

3、體蛋白表達(dá)羞的變化。在現(xiàn)有的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)中，雙向電泳(twodimensionalelectrophoresis，2DE)技術(shù)已經(jīng)是一種成熟的蛋白分離技術(shù)，因其能夠同時(shí)分離和顯示數(shù)以千計(jì)的蛋白這一獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，以及相關(guān)儀器和試劑成本相對(duì)低廉，成為大多數(shù)研究者的首選。2004年新發(fā)明的“SilverBlue”染色方法是對(duì)1988年NeuhoffJY法的改進(jìn)，這種膠體考馬斯亮藍(lán)G250染色法已經(jīng)能達(dá)到ng級(jí)敏感度，改變了以往mg級(jí)上樣量也

4、只能得到不足一千個(gè)點(diǎn)的狀況。應(yīng)用這種方法，我們?cè)趌mg總l樣量時(shí)常能得到兩千余蛋白斑點(diǎn)。并且其很好的可重復(fù)性是銀染很難達(dá)到的。研究采用的質(zhì)譜方法是基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)闖質(zhì)譜(matrixassistedlaserdesorption／ionizationtimeofflightmassspectrometry，MAU)I1DFMS)和時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(MAIDl1DF／1DFMS)，后者可以將酶解肽段進(jìn)一步解離成次第減少一個(gè)氨基酸的肽