左旋丁苯酞對血管性癡呆小鼠認知功能的影響及對PI3K-Akt信號轉導通路的作用.pdf

1、血管性癡呆(vasculardementia，VaD)是指各種腦血管疾病引起的腦功能障礙而產(chǎn)生的獲得性智能損害綜合征。VaD以學習、記憶功能損害為主要癥狀，可伴有運動、語言、視空間及人格障礙。隨著社會人口日益老齡化和腦卒中后生存率的提高，由腦卒中造成的精神及智能損害日益突出，給社會和家庭帶來沉重負擔。腦卒中后缺血-再灌注是誘發(fā)VaD的主要原因之一。
　　 腦缺血可以誘導腦梗死或選擇性腦神經(jīng)元死亡，當缺血發(fā)生在與學習、記憶密切相關

2、的區(qū)域時，即可導致VaD的發(fā)生。海馬是學習記憶的關鍵部位，同時又是缺血缺氧的敏感部位。但導致海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞死亡的調控機制目前不祥。細胞的死亡方式有2種:細胞壞死和程序性細胞死亡，其中程序性細胞死亡有Ⅱ型（細胞凋亡）和Ⅱ型（自噬性細胞死亡）兩種。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt，phosphoinositide3kinase/Akt)信號轉導途徑是一個經(jīng)典抗凋亡、促存活的信號轉導途徑。它的激活在神經(jīng)細胞，尤其在缺血

3、缺氧神經(jīng)元損傷中起著重要作用，并逐漸受到廣泛重視。近年來發(fā)現(xiàn)其與自噬的調節(jié)密切相關。PI3K/Akt信號轉導通路在腦缺血和神經(jīng)退行性變中的作用已被廣泛研究，已有研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號轉導通路與學習認知有關。但PI3K/Akt信號轉導通路在VaD發(fā)病機制中的作用尚不清楚。因此，研究PI3K/Akt信號通路與VaD的關系，對于VaD的基礎及臨床研究，具有重要的指導意義。
　　 丁苯酞(3-n-butylphthalide，Na

4、P)是中國醫(yī)學科學院藥物研究所研制開發(fā)的一類新型抗腦缺血藥物，對急性缺血性腦卒中有明顯療效。既往研究發(fā)現(xiàn)丁苯酞具有多靶點抗腦缺血作用，能改善缺血區(qū)局部腦血流，縮小腦梗死面積，改善線粒體功能，抑制自由基的產(chǎn)生，抑制炎癥反應，抑制谷氨酸釋放，減輕腦缺血所致腦水腫，抗血栓形成和抗血小板聚集，并且有研究證實能抑制神經(jīng)細胞凋亡，保護缺血缺氧引起的神經(jīng)細胞損傷，神經(jīng)功能缺失及腦缺血記憶障礙。而這些機制均與血管性癡呆的發(fā)生有關。近年來，左旋丁苯酞(1

5、-NBP)和右旋丁苯酞(d-NBP)已經(jīng)被拆分，并且將拆分后的1-NBP和d-NBP進行了對比研究后發(fā)現(xiàn)，1-NBP比d-NBP的作用更強，而且還發(fā)現(xiàn)在對神經(jīng)細胞凋亡研究中d-NBP的存在降低了dl-NBP的作用，從而證明d-NBP有拮抗1-NBP作用，因而開發(fā)1-NBP的意義更為重。目前該藥應用于VaD的實驗研究少有報道，更無其與PI3K/Akt信號轉導通路之間關系的報道?；诖耍疚臄M通過觀察PI3K/Akt信號轉導通路在VaD小鼠

6、海馬組織中的變化，以及1-NBP對VaD的影響，以探討PI3K/Akt信號轉導通路在VaD的發(fā)病機制中的作用及1-NBP的作用機制。
　　 第一部分:血管性癡呆小鼠模型的建立和左旋丁苯酞的防治作用
　　 目的:觀察腦反復缺血再灌注后C57BL/6小鼠行為學的改變和海馬病理學特征變化，并觀察1-NBP對腦反復缺血再灌注誘導的VaD小鼠空間學習記憶障礙的影響。
　　 方法:
　　 將C57BL/6小鼠隨機分為

7、假手術組（sham組）、模型組（IR組，造模后植物油灌胃6ml.kg-1.d-1，連續(xù)28天）、左旋丁苯酞預防性治療組（Pre-1-NBP組，造模前7天左旋-丁苯酞灌胃30mg.kg-1.d-1，連續(xù)7天）、左旋丁苯酞低劑量治療組（Low-1-NBP組，造模后左旋-丁苯酞灌胃30mg.kg-1.d-1，連續(xù)28天）和左旋丁苯酞高劑量治療組（High-1-NBP組，造模后左旋-丁苯酞灌胃60mg.kg-1.d-1，連續(xù)28天）;除假手術組

8、外均給予雙側頸總動脈反復三次缺血-再灌注方法建立小鼠VaD模型，假手術組僅暴露頸總動脈不結扎。造模4周后通過Morris水迷宮試驗和跳臺試驗進行學習和記憶成績測試，觀察其行為學改變;應用琉堇染色觀察海馬病理學特征變化。
　　 結果:
　　 1.空間學習記憶能力的改變——Morris水迷宮實驗
　　 在定位航行實驗中，IR組小鼠的尋臺潛伏期明顯長于Sham組小鼠[F(1，27)=30.09，p＜0.01]。1-NB

9、P各組小鼠尋臺潛伏期與IR組小鼠相比明顯縮短[F(3，50)=10.315，P＜0.01]。在實驗的第2-5天，sham組小鼠、Pre-1-NBP組小鼠尋臺潛伏期明顯短于IR組小鼠(P＜0.05，P＜0.01);在實驗的第3-5天，Low-1-NBP組和High-1-NBP組小鼠尋臺潛伏期明顯短于IR組小鼠(P＜0.05，P＜0.01)。
　　 在空間探索試驗中，與IR組小鼠相比，Sham組小鼠對目標象限表現(xiàn)出明顯的偏愛(P＜0

10、.01)。與IR組小鼠相比，High-1-NBP和Pre-1-NBP組小鼠對目標象限表現(xiàn)出明顯的偏愛(P＜0.05，P＜0.01)。
　　 2.被動逃避反應的改變——跳臺實驗
　　 2.1下臺潛伏時間:IR組與Sham組相比小鼠的首次跳下平臺的潛伏時間明顯縮短(P＜0.01），提示小鼠記憶形成功能受損;Low-1-NBP組、High-1-NBP組和Pre-1-NBP組與IR組相比跳下平臺的潛伏時間明顯增加（P＜0.05）

11、，提示1-NBP可改善小鼠記憶形成功能。
　　 2.2錯誤次數(shù):IR組與Sham組相比小鼠跳下平臺的錯誤次數(shù)明顯增多(P＜0.05），Low-1-NBP組、High-1-NBP組和Pre-1-NBP組與IR組相比跳下平臺的錯誤次數(shù)明顯減少，但無統(tǒng)計學意義(P＞0.05）。
　　 3小鼠海馬的組織病理學改變
　　 硫堇染色顯示，sham組小鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元排列整齊、致密，細胞形態(tài)完整，胞核飽滿，核仁清晰。I

12、R組小鼠海馬CA1區(qū)可見片段性的錐體細胞缺失，部分細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，可見胞體縮小，形態(tài)不規(guī)則，呈梭型或多角形，胞核固縮、濃染，核仁模糊不清或消失。與IR組相比，Low-1-NBP組、High-1-NBP組和Pre-1-NBP組小鼠海馬CA1區(qū)的錐體細胞缺失明顯減輕。
　　 結論:
　　 1.本實驗通過雙側頸總動脈反復三次缺血-再灌注方法成功的建立了C57BL/6小鼠VaD模型。預防性和治療性應用1-NBP可以減輕Va

13、D小鼠學習和記憶障礙，尤以預防性應用1-NBP效果顯著。
　　 2.反復缺血再灌注4周后小鼠海馬組織CA1區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)細胞片段性缺失、排列紊亂、神經(jīng)元密度降低等改變。預防性和治療性應用1-NBP可以減輕VaD小鼠海馬組織病理學變化，進而改善其學習和記憶能力。
　　 第二部分:PI3K激動劑及抑制劑對血管性癡呆小鼠認知功能的影響
　　 目的:觀察PI3K激動劑及抑制劑對VaD小鼠認知功能的影響。
　　 方法:

14、將C57BL/6小鼠隨機分為假手術組（sham組）、激動劑組(IR+IGF-1組，手術前及手術24小時后經(jīng)側腦室給予IGF-12ul/mouse)、激動劑溶劑對照組(IR+DW組，手術前及手術24小時后經(jīng)側腦室給予去離子水2μl/mouse)、抑制劑組(IR+LY294002組，手術前及手術24小時后經(jīng)側腦室給予LY29400210nmol/mouse)和抑制劑溶劑對照組(IR+DMSO組，手術前及手術24小時后經(jīng)側腦室給予同等體積(2

15、μl)的溶劑）;除假手術組外均給予雙側頸總動脈反復三次缺血-再灌注方法建立小鼠VaD模型，側腦室插管給予相應試劑;假手術組僅暴露頸總動脈不結扎。造模4周后通過Morris水迷宮試驗進行學習和記憶成績測試，觀察其行為學改變;應用WesternBlot方法測定各組小鼠海馬組織中Akt及p-AktSer473蛋白的變化。
　　 結果:
　　 1.空間學習記憶能力的改變——Morris水迷宮實驗
　　 在定位航行實驗中，

16、Sham組和IR+IGF-1組小鼠的尋臺潛伏期明顯短于IR+DW組、IR+LY294002組、IR+DMSO組小鼠[F(4，45)=9.702，P＜0.01]。
　　 在空間探索試驗中，與IR+DW組、IR+LY294002組、IR+DMSO組小鼠相比，sham組和IR+IGF-1組小鼠對目標象限表現(xiàn)出明顯的偏愛(P＜0.01)。
　　 2.Akt、pAktSer473在海馬組織中表達的變化
　　 術后4周Sha

17、m組、IR+DW組、IR+IGF-1組、IR+DMSO組和IR+LY294002組之間Akt總蛋白表達無明顯差異(P＞0.05);IR+DW組、IR+IGF-1組、IR+DMSO組和IR+LY294002組的p-AktSer473的蛋白表達明顯高于sham組（P＜0.01，P＜0.05）。IR+IGF-1組p-Akt的蛋白表達明顯高于IR+DW組、IR+DMSO組和IR+LY294002組（P＜0.05）。IR+LY294002組p-A

18、kt的蛋白表達低于IR+DMSO組(P＜0.05)。
　　 結論:
　　 PI3K激動劑IGF-1可以減輕VaD小鼠學習記憶功能障礙，促進海馬組織中p-AktSer473表達。其機制可能為IGF-1激活PI3K/Akt信號轉導通路，通過調節(jié)神經(jīng)細胞的凋亡和自噬，從而改善VaD小鼠的認知功能。
　　 第三部分:血管性癡呆小鼠海馬組織中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR表達水平變化及左旋丁苯酞的影響
　

19、　 目的:觀察血管性癡呆小鼠海馬組織中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR表達水平的變化及1-NBP的干預作用。
　　 方法:造模4周后采用Western-Blot方法測定各組小鼠海馬組織中Akt、p-AktSer473、mTOR和p-mTORSer2448蛋白的變化;采用免疫組化方法測定各組小鼠海馬組織中p-AktSer473蛋白的變化。
　　 結果:
　　 1.左旋丁苯酞對Akt、p-AktSer47

20、3蛋白表達的影響
　　 腦反復缺血再灌注術后4周各組之間Akt總蛋白表達無明顯差異（P＞0.05）;與sham組相比，IR組、Pre-1-NBP組、Low-1-NBP組和High-1-NBP組p-AktSer473蛋白表達明顯增強(P＜0.01);與IR組相比，Pre-1-NBP組、Low-1-NBP組和High-1-NBP組三組p-AktSer473的表達明顯增強(P＜0.01)。
　　 2.左旋丁苯酞對mTOR、p-

21、mTORSer2448蛋白的表達的影響:
　　 腦反復缺血再灌注術后4周各組之間mTOR總蛋白表達無明顯差異(P＞0.05);IR組海馬組織p-mTORSer2448的蛋白明顯高于sham組(P＜0.01)。Pre-1-NBP組、Low-1-NBP組和High-1-NBP組三組海馬組織p-mTORSer2448的蛋白表達明顯高于IR組(P＜0.01，P＜0.05)。
　　 結論:
　　 1.腦反復缺血再灌注4周后

22、，VaD小鼠海馬組織中p-AktSer473、p-mTORSer2448的表達明顯增多。提示腦反復缺血再灌注使PI3K/Akt通路活化，Akt和mTOR活化可抵抗缺血引起的損傷，在神經(jīng)元的存活中發(fā)揮著重要的作用。
　　 2.左旋丁苯酞可促進VaD小鼠海馬組織中p-AktSer473和p-mTORSer2448的表達。提示該藥可能通過激活PI3K/Akt通路，促進p-AktSer473和p-mTORSer2448的表達，從而發(fā)揮神

23、經(jīng)保護作用，改善小鼠認知功能障礙和神經(jīng)損害。
　　 第四部分:血管性癡呆小鼠海馬組織中自噬因子LC3B和Beclin1表達水平變化及左旋丁苯酞的影響
　　 目的:觀察血管性癡呆小鼠海馬組織中LC3B和Beclin1蛋白及mRNA表達的變化及1-NBP的干預作用。
　　 方法:造模4周后應用WesternBlot方法測定各組小鼠海馬組織中LC3B蛋白表達的變化，應用FQRT-PCR方法測定各組小鼠海馬LC3B和Be

24、clin1mRNA表達的變化
　　 結果:
　　 1.LC3B蛋白的表達情況:
　　 術后4周IR組海馬組織LC3B蛋白表達明顯高于sham組、Pre-1-NBP組和High-1-NBP組（P＜0.01）。
　　 2.LC3B、Beclin1的mRNA表達水平
　　 IR組小鼠海馬LC3BmRNA和Beclin1mRNA的表達比Sham組明顯增加（P＜0.05）;Pre-1-NBP組、Low-1-

25、NBP組和High-1-NBP組三組海馬組織中LC3BmRNA和Beclin1mRNA的表達無組間差異(P＞0.05)，與Sham組相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，但較IR組明顯下降(P＜0.01，P＜0.05)。
　　 結論:
　　 1.腦反復缺血再灌注4周后，小鼠海馬組織LC3B蛋白、LC3BmRNA和Beclin1mRNA表達均顯著升高，與小鼠行為學改變和神經(jīng)元損傷基本一致。
　　 2.左旋丁苯酞降低小鼠

26、海馬組織LC3B蛋白、LC3BmRNA和Beclin1mRNA表達（與其上游抑制物p-mTOR的表達相反）。提示1-NBP可能通過激活PI3K/Akt通路抑制自噬，從而減少VaD小鼠海馬神經(jīng)元損傷，減輕認知功能障礙。
　　 第五部分:血管性癡呆小鼠側腦室室管膜掃描電鏡的變化特征及左旋丁苯酞的影響
　　 目的:觀察VaD小鼠側腦室脈絡叢上皮細胞和室管膜細胞的超微結構變化，以及1-NBP的影響。
　　 方法:通過掃描

27、電鏡觀察造模4周后sham組、IR組和High-1-NBP組小鼠側腦室脈絡叢上皮細胞和室管膜細胞超微結構的變化。
　　 結果:
　　 1.小鼠側腦室脈絡叢上皮細胞超微結構特點
　　 Sham組側腦室脈絡叢上皮細胞細胞胞體形狀規(guī)則，細胞之間界限清晰，微絨毛密布上皮細胞游離面，較粗短，細胞表面可見大小不一的分泌泡。IR組小鼠側腦室脈絡叢上皮細胞形狀變得極不規(guī)則，有的細胞有突起，有的呈溝回樣皺縮，有的細胞表面光滑，并可

28、見大量的分泌泡，分泌物增多，細胞間界限不清，細胞表面呈泥沙樣堆積，脈絡叢上皮細胞上微絨毛明顯減少甚至消失。High-1-NBP組小鼠側腦室脈絡叢上皮細胞排列尚規(guī)律，細胞間界限較清晰。
　　 2.小鼠側腦室室管膜表面超微結構特點
　　 sham組小鼠可見室管膜上皮細胞表面帶有大量的纖毛和微絨毛，纖毛，粗細較為均勻，在纖毛的空隙處，分布著眾多的微絨毛。IR組小鼠室管膜上皮細胞表面可見纖毛稀疏、倒伏，部分粘附呈縷。部分纖毛表面