丁苯酞對血管性癡呆大鼠學習記憶障礙的實驗研究.pdf

1、背景和目的:血管性癡呆是指腦血管疾病所致，以學習記憶減退為主要臨床表現(xiàn)的慢性獲得性嚴重認知功能障礙綜合征，為腦血管疾病常見后遺癥。目前認為細胞凋亡是血管性癡呆的發(fā)病機制之一。
　　 海馬是與學習記憶功能有關(guān)的主要腦功能區(qū)，易被缺血損傷。研究認為慢性腦缺血可引起海馬的細胞凋亡，變性，萎縮，損傷后常常引起學習、記憶功能障的出現(xiàn)，為血管性癡呆的病理基礎(chǔ)。
　　 iNOS為誘導型一氧化氮合成酶。p38MAPK是p38MAPK信號

2、傳遞通路的主要成員。多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，iNOS和p38MAPK在急性性腦缺血組織中通過細胞凋亡參與了腦組織的損傷過程。
　　 丁苯酞是我國自行研制的國家一類治療非出血性卒中的新生代抗腦缺血藥物。它不僅可從重新構(gòu)建缺血組織區(qū)域供血路徑對缺血腦組織達到保護，而且可從給予線粒體保護，減少鈣庫釋放鈣離子等多個環(huán)節(jié)抵抗細胞凋亡，從而起到抵御腦缺血損傷作用，使腦神經(jīng)功能達到復原，達到對臨床癥狀減輕的目的。它對細胞凋亡雖有抵御作用，但細胞凋亡這一

3、過程相當復雜，用它來對血管性癡呆學習記憶障礙治療是否會產(chǎn)生效果，目前報道不多。我們擬采用血管性癡呆大鼠模型，以海馬為研究部位，iNOS與p38MAPK表達情況、細胞凋亡情況及學習記憶能力為觀察指標，觀察它們在丁苯酞干預后的變化，以期為臨床治療血管性癡呆尋找新的藥物并探討血管性癡呆的具體分子機制。
　　 材料與方法:
　　 1.實驗動物的分組：把42只成年雄性Wistar大鼠隨機等分為假手術(shù)組，模型組，丁苯酞組。
　

4、　 2.實驗動物模型的制作：用雙頸總動脈永久結(jié)扎方法。三組大鼠均腹腔內(nèi)注射麻醉，成功后沿頸部正中縱向切開皮膚，鈍性分離開皮下筋膜及肌肉組織至雙側(cè)頸總動脈。模型組與丁苯酞組的大鼠，每側(cè)頸總動脈用0號手術(shù)絲線進行雙結(jié)扎，從中間剪斷，縫合手術(shù)切口。術(shù)后保暖，待蘇醒，放回清潔籠箱繼續(xù)飼養(yǎng)。假手術(shù)組的大鼠除不做結(jié)扎外，亦按上述手術(shù)過程進行操作。
　　 3.試驗給藥劑量、方法及持續(xù)時間：術(shù)后2周，丁苯酞治療組按65 mg/kg，給予灌胃，

5、模型組與假手術(shù)組進行同樣的過程，但沒給藥物。三組均每天一次，連續(xù)2月。
　　 4.大鼠學習記憶行為能力的測定：2月后用Y-型迷宮測試各組大鼠學習記憶能力，以大鼠受電擊后直接跑到安全區(qū)為正確反應(yīng)，以連續(xù)10次中出現(xiàn)9次正確反應(yīng)前所需的電擊次數(shù)代表大鼠學習能力。24小時后，每個大鼠測試10次，記下10次中出現(xiàn)的正確反應(yīng)次數(shù)，以正確反應(yīng)次數(shù)代表記憶能力。
　　 5.海馬組織切片的制作：迷宮試驗后，把海馬組織從已排凈血液的大腦中

6、分離出來，放入到4％甲醛內(nèi)并保持2釩然后常規(guī)脫水，透明，浸蠟，包埋，冠狀方向切片(厚5μm)以備用。
　　 6.免疫組化及Tunel染色：按iNOS和p38MAPK免疫組化及Tunel試劑盒要求進行染色，并在400倍光學顯微鏡下觀察。
　　 7.圖像采集分析：用德國Lecia顯微照像系統(tǒng)和Biosens Digital ImagingSystem v1.6在每個大鼠的每張切片上隨機選取面積大致相同測3個視野，照相并測定灰

7、度值，取平均值作為該切片結(jié)果，然后把所有切片結(jié)果再取平均值，均用均數(shù)±標準差(x±s)表示。
　　 8.數(shù)據(jù)統(tǒng)計學檢驗：用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，單因素方差分析，組間用LSD法，P<0.05有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.三組大鼠學習、記憶能力情況：三組大鼠中，以假手術(shù)組大鼠的學習速度最快，遺忘最少。學習時，連續(xù)10次中出現(xiàn)9次正確反應(yīng)的這一結(jié)果出現(xiàn)前所需的電擊次數(shù)最少，為34.07±3.09次；24小

8、時后正確反應(yīng)遺留了8.07±1.07次。而丁苯酞組較慢，學會要求所需的電擊次數(shù)為60.78±4.26次，遺忘較多，遺留6.42±1.45次。模型組最慢，學會要求時所需的電擊次數(shù)為74.21±3.0次，24小時后10次中正確反應(yīng)次數(shù)遺留了4.64±1.49次。三組之間統(tǒng)計學比較有明顯差異，P值均小于0.05。
　　 2.海馬區(qū)iNOS免疫組化染色情況：iNOS免疫組化染色應(yīng)該出現(xiàn)在細胞漿中，為不同程度的棕黃色。在假手術(shù)組中，光鏡下

9、僅見到極少量淡棕黃色的細胞；而在模型組可見深棕黃色，數(shù)目較多；丁苯酞組見到是棕黃色，數(shù)目較少。三組中陽性細胞區(qū)平均灰度值，丁苯酞組(72.51±4.80)大于假手術(shù)組的(7.07±2.33)低于模型組：72.51±4.80。與假手術(shù)及模型組比較，P<0.05。
　　 3.海馬區(qū)p38MAPK免疫組化染色情況：p38MAPK染色出現(xiàn)在胞核中，染色程度只不過因p38MAPK含量的多少而不同。在假手術(shù)組中，光鏡下僅見到少量淺棕黃色細胞

10、；而在模型組見到多量深棕黃色細胞。在丁苯酞組，見到的陽性細胞是棕黃色，且數(shù)目相對模型組而言較少，而較假手術(shù)組多。三組中陽性細胞區(qū)平均灰度值，丁苯酞組的(65.02±4.14)大于假手術(shù)組的(10.20±2.32)低于模型組：70.72±4.81，與假手術(shù)及模型組比較P<0.05。
　　 4.海馬區(qū)細胞凋亡Tunel染色情況：在假手術(shù)組中有少量細胞核被染成棕色的細胞存在，胞質(zhì)濃縮，胞體減小，核碎裂散開。模型組出現(xiàn)這樣的細胞明顯增多

11、。在丁苯酞組，這樣的細胞同樣被看到，但數(shù)目較模型組減少而多于假手術(shù)組。三組中細胞凋亡數(shù)目以模型組的最多，丁苯酞組的數(shù)目次之，在假手術(shù)組出現(xiàn)的數(shù)目最少。分別為(61.92±4.19)％；(35.00±3.32)％；(5.07±2.40)％，P<0.05。
　　 結(jié)論:
　　 1.丁苯酞對血管性癡呆大鼠的學習記憶障礙能夠起到改善作用。
　　 2.iNOS和p38MAPK與血管性癡呆學習記憶障礙發(fā)生發(fā)展存在著一定關(guān)系。