ROS與PI3K-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在苯致白血病中的作用.pdf

1、苯(benzene,BZ)是一種低分子量的碳?xì)浠衔?，隨著工業(yè)發(fā)展和人們生活水平的提高，苯污染形勢(shì)日趨嚴(yán)峻。人們?cè)诠I(yè)生產(chǎn)和日常生活中都可能接觸苯。苯可通過(guò)呼吸道、消化道和皮膚進(jìn)入機(jī)體，進(jìn)入人體的苯在肝臟中被CYP2E1氧化為具有毒性的代謝產(chǎn)物。不斷積累的資料顯示，苯可引起造血系統(tǒng)多種功能障礙，包括所有類(lèi)型的白血病、淋巴瘤、骨髓增生和再生障礙性貧血，國(guó)際癌癥研究所(IARC)將其定為Ⅰ類(lèi)致癌物，而苯導(dǎo)致中毒的機(jī)制目前仍不完全清楚，對(duì)苯及

2、其代謝產(chǎn)物對(duì)造血系統(tǒng)毒作用機(jī)制的研究仍是今后重要的研究方向，而信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，因此在苯致白血病機(jī)制研究領(lǐng)域中，發(fā)現(xiàn)異常的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是其中的研究熱點(diǎn)之一。 在許多腫瘤如白血病、乳腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌中發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/Serine-threonine kinase，PI3K/Akt)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，AKt在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)

3、轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中位于PI3K的下游，主要通過(guò)PI3K激活，該通路的活化導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖過(guò)度、凋亡受抑。 PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以調(diào)節(jié)許多信號(hào)分子，同時(shí)，其本身也受信號(hào)分子的調(diào)控。其中，最可能的調(diào)控分子是活性氧(reactive oxygen species，ROS)。在白血病中過(guò)氧化氫(H2O2)和羥自由基(OH·)是ROS的主要型式。研究表明在BZ及其代謝物引起的細(xì)胞毒性和致癌性中，氧化損傷起重要作用。 鑒于在白血病

4、中存在氧化損傷和PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活，并且兩者可能存在調(diào)控與被調(diào)控關(guān)系，我們?cè)O(shè)想苯可能通過(guò)誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生激活PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致對(duì)血液系統(tǒng)的損傷。為驗(yàn)證這個(gè)設(shè)想，本課題選擇苯代謝產(chǎn)物中的1，4-苯醌作為受試物，采用急性早幼粒白血病細(xì)胞HL-60細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。 本課題研究目的是：觀(guān)察苯醌導(dǎo)致的氧化應(yīng)激與PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在HL-60細(xì)胞增殖中的作用，進(jìn)而了解ROS與PI3K/Akt信

5、號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在苯致白血病中的作用，為預(yù)防和治療苯導(dǎo)致的血液中毒提供新的依據(jù)。 研究方法： 1.觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，檢測(cè)細(xì)胞存活率 用BQ/PBS對(duì)HL-60細(xì)胞進(jìn)行染毒處理，設(shè)空白對(duì)照、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L六個(gè)劑量組。染毒2h后，重新接種于新的培養(yǎng)基中，孵育18h后，收獲細(xì)胞，并觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)，臺(tái)盼藍(lán)拒染法觀(guān)察細(xì)胞存活水平。 2.檢測(cè)細(xì)胞增殖率

6、 用BQ/PBS對(duì)HL-60細(xì)胞進(jìn)行染毒處理，設(shè)空白對(duì)照、1 μmol/L、3μmol/L、5μmol/L四個(gè)劑量組。染毒2h后，然后重新接種于含3％血清的培養(yǎng)基中，孵育18h后，收獲細(xì)胞，alamar blue法檢測(cè)細(xì)胞增殖率。 3.過(guò)氧化氫清除劑(過(guò)氧化氫酶)和PI3K抑制劑(LY294002)預(yù)處理對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的影響 HL-60細(xì)胞設(shè)對(duì)照組、3μmol/L，BQ染毒組、CAT+3μmol/L BQ染毒組

7、、LY294002+3μmol/L BQ染毒組四組。染毒2h后，然后重新接種于含3％血清的培養(yǎng)基中，孵育18h后，收獲細(xì)胞，alamar blue法檢測(cè)細(xì)胞增殖率。 4.過(guò)氧化氫清除劑(過(guò)氧化氫酶)和PI3K抑制劑(LY294002)預(yù)處理對(duì)HL-60細(xì)胞產(chǎn)成ROS的影響 HL-60細(xì)胞設(shè)對(duì)照組、3μmol/L BQ染毒組、CAT+3μmol/L BQ染毒組、LY294002+3μmol/L BQ染毒組四組。染毒2h后，

8、收獲細(xì)胞。DCFH-DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS。 5.苯醌染毒及過(guò)氧化氫清除劑(過(guò)氧化氫酶)、PI3K抑制劑(LY294002)預(yù)處理對(duì)HL-60細(xì)胞內(nèi)p-Akt和Akt表達(dá)的影響 HL-60細(xì)胞設(shè)對(duì)照組、3μmol/L BQ染毒組、CAT+3μmol/L BQ染毒組、LY294002+3μmol/L BQ染毒組四組。染毒5min后，收獲細(xì)胞。Western blot方法檢測(cè)各組HL-60細(xì)胞內(nèi)p-Akt和Akt表達(dá)的

9、影響。 6.細(xì)胞周期觀(guān)察 HL-60細(xì)胞設(shè)對(duì)照組、3μmol/L BQ染毒組、CAT+3μmol/L BQ染毒組、LY294002+3μmol/L BQ染毒組四組。染毒2h后，然后重新接種于含3％血清的培養(yǎng)基中，孵育18h后，收獲細(xì)胞，用PI染液處理細(xì)胞，即可進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。 7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)平行樣，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件建立實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)庫(kù)，以((-x)±s)表示定量指標(biāo)的平均

10、值，根據(jù)資料特征采用x2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 研究結(jié)果： 1.對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的觀(guān)察，對(duì)細(xì)胞存活率的檢測(cè) 低濃度劑量苯醌(≤5μmol/L)作用于HL-60細(xì)胞后，光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞外形規(guī)則，活細(xì)胞數(shù)明顯較空白對(duì)照組多；中等濃度劑量苯醌(10μmol/L)作用于HL-60細(xì)胞后，可見(jiàn)有少許變形細(xì)胞；高濃度劑量苯醌(≥10μmol/L)作用于HL-60細(xì)胞后，細(xì)胞大量死亡。臺(tái)盼藍(lán)染色后，染毒濃度低于5μmol/L的劑量

11、組，細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比無(wú)明顯降低，而高于10μmol/L的劑量組，細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比則明顯降低。 2.確定苯醌最終染毒劑量 根據(jù)alamar blue染色結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)確定了能夠引起HL-60細(xì)胞增殖最明顯的苯醌染毒劑量3μmol/L。 3.過(guò)氧化氫清除劑(過(guò)氧化氫酶)和PI3K抑制劑(LY294002)預(yù)處理對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的影響 CAT+BQ染毒組與LY294002+BQ染毒組細(xì)胞增殖情況均

12、低于BQ染毒組。 4.過(guò)氧化氫清除劑(過(guò)氧化氫酶)和PI3K抑制劑(LY294002)預(yù)處理對(duì)HL-60細(xì)胞產(chǎn)成ROS的影響 BQ染毒組細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS量比對(duì)照組多； CAT+BQ染毒組細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS量比BQ染毒組低； LY294002+BQ染毒組細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS量與BQ染毒組相比沒(méi)有差別。 5.苯醌染毒及過(guò)氧化氫清除劑(過(guò)氧化氫酶)、PI3K抑制劑(LY294002)預(yù)處理對(duì)HL-60細(xì)胞內(nèi)p-Ak

13、t和Akt表達(dá)的影響 BQ染毒組HL-60細(xì)胞p-Akt蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比明顯增加；CAT+BQ染毒組HL-60細(xì)胞p-Akt蛋白表達(dá)量約是BQ染毒組的三分之一；LY294002+BQ染毒組HL-60細(xì)胞p-Akt蛋白表達(dá)量也約是BQ染毒組的三分之一。對(duì)照組、BQ染毒組、CAT+BQ染毒組和LY294002+BQ染毒組細(xì)胞內(nèi)Akt表達(dá)水平無(wú)明顯差別。 6.細(xì)胞周期觀(guān)察 BQ染毒組進(jìn)入S、G2期HL-60細(xì)胞比

14、例均比對(duì)照組高，而進(jìn)入G1期的細(xì)胞比例則比對(duì)照組低；CAT+BQ染毒組和LY294002+BQ染毒組分別與BQ染毒組相比，二者進(jìn)入S、G2期HL-60細(xì)胞比例均比BQ染毒組低，而進(jìn)入G1期的細(xì)胞比例均比BQ染毒組高。 結(jié)論： 1.本實(shí)驗(yàn)用苯醌對(duì)急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞HL-60進(jìn)行染毒，建立促進(jìn)該細(xì)胞增殖的方法，模擬了白血病骨髓內(nèi)粒細(xì)胞的異常增長(zhǎng)。 2.在苯醌促HL-60細(xì)胞增殖過(guò)程中，ROS與PI3K/Akt起著重