荷載Ki67小干擾RNA的條件增殖腺病毒介導(dǎo)的腎癌靶向治療的研究.pdf

1、腎癌確診時(shí)30％-40％已有轉(zhuǎn)移，5年生存率不足10％。其對化療、放療、免疫治療均不敏感，因此迫切需要尋找新的治療方法。RNA 干擾(RNAinterfererice，RNAi)是近年迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)新的基因阻斷技術(shù)，它是將與靶基因同源的小片段雙鏈RNA(small interfering RNAs，siRNA)轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，從而特異性降解靶基因 mRNA，RNAi 有望成為腫瘤基因治療的有力工具。但基因治療方案至今沒有取得實(shí)質(zhì)上的突破

2、，使得基因-病毒治療應(yīng)運(yùn)而生。 基因-病毒治療是讓條件增殖腺病毒(Cotlditionally replicative adenovirus，CRAds)攜帶治療基因，利用CRAds的特異性增殖能力，使治療基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)成千上萬倍的增加，同時(shí)CRAds本身也有腫瘤殺傷作用。構(gòu)建CRAds 的方法之一是將腺病毒在正常細(xì)胞中復(fù)制必需，而在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制不需要的基因如E1B 55Kda蛋白基因刪除。目前攜帶siRNA的CRAds治療

3、腫瘤研究僅有幾篇報(bào)道，其中用于腎癌的研究尚未見報(bào)道，本研究將針對腫瘤增殖基因Ki67的siRNA插入CRAds構(gòu)建ZD-Ki67，體外及動物實(shí)驗(yàn)研究其對腎癌的靶向治療作用。 第一部分 Ki67 siRNA 有效序列的確定、表達(dá)載體的構(gòu)建及其對腎癌的治療作用 合成針對 Ki67 cDNA 364～382 堿基的 Ki67-siRNA，將 Ki67-siRNA(100nmol/L)轉(zhuǎn)染人腎癌 786-0 細(xì)胞。采用 RT-P

4、CR、Western blot、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測不同水平的Ki67表達(dá)，MTT 法檢測細(xì)胞增殖，免疫組化 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ki67-siRNA處理組786-0細(xì)胞Ki67表達(dá)降低，細(xì)胞增殖抑制率增加，凋亡細(xì)胞陽性率增加。結(jié)果表明我們篩選的 Ki67-siRNA 能抑制腎癌細(xì)胞Ki67基因表達(dá)，進(jìn)而抑制其增殖，促進(jìn)其凋亡。根據(jù)確定的序列，構(gòu)建Ki67-siRNA表達(dá)質(zhì)粒，并研究其對人腎癌細(xì)胞Ki67基因表達(dá)及生長的

5、抑制作用。設(shè)計(jì)有小發(fā)夾機(jī)構(gòu)的二條Ki67-siRNA對應(yīng)模板DNA序列，煺火處理后克隆至pSilencer 3.1質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSilermer-Ki67。酶切及測序證實(shí)后將pSilerlcer-Ki67 轉(zhuǎn)染人腎癌 786-0 細(xì)胞及荷786-0 裸鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn) pSilencer-Ki67可顯著抑制 786-0細(xì)胞及移植瘤組織Ki67表達(dá)，進(jìn)而抑制其增殖、促進(jìn)其凋亡。為我們構(gòu)建攜帶 Ki67-siRNA 的 CRAds 打下基

6、礎(chǔ)。 第二部分 荷載 Ki67 siRNA 的條件增殖腺病毒的構(gòu)建 雖然Ki67-siRNA 及其表達(dá)質(zhì)?？梢杂行б种芀i67表達(dá)，但作用時(shí)間短暫是其致命缺陷，為此，我們構(gòu)建了荷載 Ki67-siRNA 的條件增殖型腺病毒。將Ki67-siRNA 模板克隆至pCA13質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCA13-Ki67。用BglⅡ從pCA13-Ki67酶切出包含CMV啟動子及Ki67-siRNA模板的表達(dá)框，一并克隆進(jìn)條件增殖腺病毒質(zhì)

7、粒pZD55，構(gòu)建重組質(zhì)粒pZD-Ki67。將pCA13-Ki67、pZD-Ki67與腺病毒右臂質(zhì)粒pBHGE3共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝成復(fù)制缺陷型腺病毒Ad-Ki67和條件增殖腺病毒ZD-Ki67。擴(kuò)增Ad-Ki67、ZD-Ki67，純化、測定滴度。 酶切分析、測序鑒定表明pea13-Ki67、pZD-Ki67構(gòu)建成功。PCR鑒定表明Ad-Ki67包含目的基因，且E1區(qū)缺失；ZD-Ki67包含目的基因，且無野生型腺病毒污染。Ad

8、-Ki67、ZD-Ki67滴度分別為4×10<'10>、1×10<'11>PFU/ml。結(jié)果證實(shí)成功構(gòu)建攜帶Ki67-siRNA 的條件增殖型腺病毒 ZD-Ki67，為靶向治療腫瘤奠定基礎(chǔ)。 第三部分 荷載Ki67 siRNA 的條件增殖腺病毒抑制腎癌細(xì)胞的體內(nèi)外研究 首先研究ZD-Ki67在腎癌細(xì)胞內(nèi)選擇性復(fù)制能力。用相同滴度(MOI=1)的表達(dá)EGFP的ZD-EGFP、Ad-EGFP分別感染786-0細(xì)胞，1d和5d

9、后熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，ZD-EGFP感染5d的786-0細(xì)胞大多數(shù)發(fā)生明顯細(xì)胞病變，表達(dá)EGFP細(xì)胞數(shù)目及熒光強(qiáng)度也大大高于Ad-EGFP感染的細(xì)胞。而ZD-EGFP感染的人腎小管HK2細(xì)胞沒有發(fā)生病變。Western blot檢測E1A表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ZD-Ki67、ZD-EGFP感染的腎癌 786-0、ACHN 細(xì)胞檢測到 E1A 表達(dá)，Ad-Ki67感染細(xì)胞無E1A表達(dá)。結(jié)果表明，ZD-Ki67 可在腎癌細(xì)胞內(nèi)選擇性復(fù)制。在此基礎(chǔ)上研

10、究 ZD-Ki67對腎癌細(xì)胞的影響。將不同 MOI的ZD-Ki67、Ad-Ki67、ZD-EGFP感染腎癌786-0、ACHN 細(xì)胞，分別于不同時(shí)間收集腫瘤細(xì)胞，結(jié)晶紫染色檢測病毒對腎癌細(xì)胞的毒性作用，MTT法檢測細(xì)胞增殖，TUNEL 法檢測細(xì)胞凋亡，分別采用 RT-PCR、Western blot 及細(xì)胞免疫化學(xué)檢測Ki67表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對 786-0、ACHN 細(xì)胞殺傷及增殖抑制作用強(qiáng)度依次為 ZD-Ki67>ZD-EGFP>Ad

11、-Ki67。誘導(dǎo) 786-0、ACHN 細(xì)胞凋亡能力及抑制Ki67表達(dá)作用依次為 ZD-Ki67>Ad-Ki67>ZD-EGFP。結(jié)果表明，病毒 ZD-Ki67 可在腎癌細(xì)胞內(nèi)選擇性地增殖，并殺傷腎癌細(xì)胞、誘導(dǎo)其凋亡。 為證實(shí) ZD-Ki67 對荷腎癌小鼠腫瘤治療作用，786-0 細(xì)胞荷瘤裸鼠移植瘤內(nèi)分別注射 7×10<'8>PF的病毒 ZD-Ki67、ZD-EGFP、Ad-Ki67 及生理鹽水，連續(xù)注射3天，每組10只。10天

12、后每組隨機(jī)處死4只裸鼠，免疫組化及激光共聚焦顯微鏡檢測移植瘤組織Ki67及E1A蛋白表達(dá)；TUNEL 法檢測移植瘤細(xì)胞凋亡；其余動物每周測量腫瘤體積，連續(xù)觀測9周。結(jié)果發(fā)現(xiàn) ZD-Ki67、Ad-Ki67、ZD-EGFP及生理鹽水處理組腫瘤體積(mm<'3>)分別為：135.5±9.2、1267.4±59.8、1711.3±75.2、2616.1±245.1，各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ad-Ki67 處理組腫瘤無E1A 蛋白的表達(dá)，ZD