Ki67啟動子調(diào)控的荷載雙基因RNA干擾的條件增殖腺病毒抑制人腎癌裸鼠移植瘤生長的實驗研究.pdf

1、目的：研究Ki67啟動子調(diào)控的荷載雙基因RNA干擾的條件增殖腺病晦(Ki67-ZD55-double-siRNA)對人腎癌細胞裸鼠皮下移植瘤生長的影響，為臨床腎癌的病毒.基因聯(lián)合治療提供依據(jù)。
　　方法：將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的Ketr-3(人腎透明細胞癌)細胞注射裸鼠皮下，構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型，建模成功后將裸鼠隨機分為5組，每組10只，分別用Ki67-ZD55病毒、Ki67-ZD55-Ki67siRNA病毒、Ki67-ZD55-h

2、TERTsiRNA病毒、Ki67-ZD55-double-siRNA病毒及PBS進行治療，病毒每次注射0.2ml(7×108PFU)，PBS注射0.2ml，隔天注射一次，共三次。在治療結(jié)束的第7天，每組隨機脫頸處死4只動物，取下瘤體組織，免疫組化法檢測瘤體內(nèi)Ki67蛋白、hTERT蛋白及E1A蛋白的表達，Western檢測E1A蛋白的表達，HE染色檢測腫瘤組織情況，TUNEL法檢測腫瘤組織細胞凋亡，其余動物繼續(xù)飼養(yǎng)，定期測量腫瘤體積，繪

3、制腫瘤時間.體積生長抑制曲線，在治療的第35天處死全部動物，測量最終體積，取下肝臟組織，HE染色觀察病毒治療的毒性作用。
　　結(jié)果：1.成功構(gòu)建人腎透明細胞癌裸鼠皮下移植瘤模型。
　　2.免疫組化顯示Ki67-ZD55-double-siRNA組Ki67蛋白的表達明顯低于其余各組，抑制Ki67表達作用由強到弱依次為Ki67-ZD55-double-siRNA>Ki67-ZD55-Ki67siRNA>Ki67-ZD55-hTE

4、RTsiRNA>Ki67-ZD55>PBS，Ki67-ZD55-double-siRNA組與其余各組之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)：免疫組化顯示Ki67-ZD55-double-siRNA組hTERT蛋白的表達明顯低于其余各組，抑制Ki67表達作用由強到弱依次為Ki67-ZD55-double-siRNA>Ki67-ZD55-hTERTsiRNA>Ki67-ZD55-Ki67siRNA>Ki67-ZD55>PBS，Ki67-

5、ZD55-double-siRNA組與其余各組之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.免疫組化法及Western顯示，病毒復(fù)制蛋白E1A在PBS組無表達，而Ki67-ZD55組、Ki67-ZD55-Ki67siRNA組、Ki67-ZD55-hTERTsiRNA組、Ki67-ZD55-double-siRNA組可見蛋白表達陽性信號，提示病毒在這四組腫瘤的瘤體內(nèi)復(fù)制。
　　4.瘤組織HE染色中PBS組細胞漿染色松散

6、色淺，可見胞核呈雙葉或多葉分裂像，提示細胞增殖活躍，而Ki67-ZD55組、Ki67-ZD55-Ki67siRNA組、Ki67-ZD55-hTERTsiRNA組、Ki67-ZD55-double-siRNA組可見到不同程度的細胞核深染，很少有核分裂像，顯示腫瘤組織生長抑制。
　　5.TUNEL檢測各治療組凋亡率分別為PBS組(4.16±1.83)％，Ki67-ZD55組(23.84±3.16)％，Ki67-ZD55-hTERTsi

7、RNA組(45.23±3.62)％，Ki67-ZD55-Ki67siRNA組(36.19±4.82)％，Ki67-ZD55-double-siRNA組(62.72±5.93)％，Ki67-ZD55-double-siRNA組與其余四組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　6.腫瘤生長抑制曲線顯示Ki67-ZD55-double-siRNA組與其余組比較，抑制腫瘤生長效果最強。
　　7.各處理組肝臟病理HE染色未見明