Ki67啟動子調控的荷載雙基因RNA干擾的條件增殖腺病毒靶向治療腎癌體外實驗研究.pdf

1、目的：研究Ki67啟動子調控的荷載Ki67-siRNA、hTERT-siRNA及Ki67-siRNA+hTERT-siRNA(double-siRNA)的條件增殖型腺病毒對腎癌的體外治療效果。
　　 方法：Ki67-ZD55、Ki67-ZD55-Ki67-siRNA、Ki67-ZD55-hTERT-siRNA、Ki67-ZD55-double-siRNA腺病毒大量擴增后測定滴度；將上述四種腺病毒分別感染腎癌KETR-3、786-

2、O、ACHN細胞及正常HK-2細胞，Western Blot檢測腺病毒E1A蛋白在細胞中的表達情況；TCID50檢測腺病毒在細胞中的復制能力；RT-PCR檢測腺病毒對細胞中Ki67基因、hTERT基因的沉默效果；免疫細胞化學檢測腺病毒對細胞中Ki67蛋白及hTERT蛋白表達的抑制情況；CCK-8法檢測腺病毒對細胞增殖的影響；Annexin V-FITC/PI法檢測腺病毒對細胞凋亡的影響；結晶紫染色檢測腺病毒的細胞毒性作用。
　　

3、 結果：1.在腎癌KETR-3、786-O、ACHN細胞中，四組病毒均表達E1A蛋白，同一細胞中Ki67-ZD55-double-siRNA組E1A蛋白表達量較Ki67-ZD55組、Ki67-ZD55-Ki67-siRNA組及Ki67-ZD55-hTERT-siRNA組E1A蛋白表達量多，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義，其病毒復制能力也最強，Ki67-ZD55-Ki67-siRNA組及Ki67-ZD55-hTERT-siRNA組E1A蛋

4、白表達量較Ki67-ZD55組E1A蛋白表達量多，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義，Ki67-ZD55的病毒復制能力也最弱，而Ki67-ZD55-Ki67-siRNA組及Ki67-ZD55-hTERT-siRNA組E1A蛋白表達量無差異(P>0.05)；在KETR-3、786-O、ACHN細胞中四種病毒E1A蛋白表達量是逐漸降低的，四種病毒在KETR-3細胞中顯示最強的復制能力，在786-O細胞中其次，在ACHN細胞中最弱；在HK-2細胞

5、中未檢測到E1A蛋白的表達，四種病毒也無復制能力。
　　 2.RT-PCR檢測結果與免疫細胞化學結果顯示在腎癌KETR-3、786-O、ACHN細胞中，Ki67-ZD55-double-siRNA組及Ki67-ZD55-Ki67-siRNA組的Ki67 mRNA的表達和蛋白的表達均明顯降低，與其它組和對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Ki67-ZD55-double-siRNA組及Ki67-ZD55-hTERT-siR

6、NA組的hTERT mRNA的表達和蛋白的表達均明顯降低與其他組和對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；四種腺病毒在KETR-3細胞中作用最明顯，在786-O細胞中作用其次，在ACHN細胞中作用較弱；在HK-2細胞中，各組的Ki67及hTERT的mRNA的表達和蛋白的表達無差異(P>0.05)。
　　 3.CCK-8法、結晶紫染色法及AnnexinV-FITC/PI法顯示四種病毒對腎癌KETR-3、786-O、ACHN細胞

7、均有殺傷作用、增殖抑制作用和誘導細胞凋亡的作用，且CCK-8法顯示病毒對細胞增殖的抑制作用與病毒的濃度及感染時間存在正相關性，其中Ki67-ZD55-double-siRNA組對腎癌細胞的殺傷作用、增殖抑制作用和誘導細胞凋亡的作用最強，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義；Ki67-ZD55-Ki67-siRNA組及Ki67-ZD55-hTERT-siRNA組作用其次，兩組間無差異(P>0.05)；Ki67-ZD55組對腎癌細胞的殺傷作用、增

8、殖抑制作用和誘導細胞凋亡的作用最弱，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。四種腺病毒在KETR-3細胞中作用最明顯，在786-O細胞中作用其次，在ACHN細胞中作用較弱；四種病毒對HK-2細胞均無明顯殺傷作用、增殖抑制作用作用和誘導細胞凋亡的作用。
　　 結論：成功構建的攜帶Ki67啟動子、Ki67-siRNA及hTERT-siRNA的條件增殖型腺病毒Ki67-ZD55、Ki67-ZD55-Ki67-siRNA、Ki67-ZD55-h