腺病毒介導(dǎo)的RNA干擾降低VEGF及其受體KDR，F(xiàn)LT轉(zhuǎn)錄抑制血管形成的研究.pdf

1、血管新生對(duì)于腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過程是十分重要的。腫瘤依靠新生血管來提供營(yíng)養(yǎng)(包括氧氣)和排泄廢物，轉(zhuǎn)移灶的形成和發(fā)展也依賴于新生血管的形成。臨床研究顯示，腫瘤誘導(dǎo)血管新生的能力決定了其生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的能力。如能有效抑制血管生成、切斷腫瘤血供，有望達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的目的。 絕大多數(shù)惡性腫瘤中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEG

2、FR)均呈高表達(dá)，形成旁/自分泌作用方式，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖，誘導(dǎo)血管新生，并直接作用于腫瘤細(xì)胞刺激其生長(zhǎng)。VEGF在一些惡性腫瘤(包括胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌和腦癌等)中表達(dá)水平顯著增高，并與腫瘤的微血管密度、惡性程度以及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。我們因而設(shè)想下調(diào)VEGF和VEGFR表達(dá)可能會(huì)抑制血管形成，進(jìn)而減緩腫瘤的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)。 RNA干擾(RNAi)是最近幾年發(fā)展起來的一門新興的抑制基因表達(dá)技術(shù)。腺病毒載體因具有感染細(xì)胞種

3、類多、感染效率高、外源基因表達(dá)水平高且既適于體外又適于體內(nèi)研究等特點(diǎn)而被廣泛用于基因治療和臨床試驗(yàn)中，所以本研究采用了腺病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)來驗(yàn)證我們的設(shè)想。結(jié)果如下： 1．我們用細(xì)菌內(nèi)同源重組的方法構(gòu)建了針對(duì)VEGF，VEGFR的SiRNA表達(dá)重組腺病毒AdH1-siRNA/VEGF，AdH1-siRNA/KDR，AdH1-siRNA/FLT，Real-time RT-CR實(shí)驗(yàn)表明，AdH1-siRNA/VEGF，AdH1-

4、siRNA/KDR，AdH1-siRNA/FLT可特異性地使血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中的VEGF，KDR，F(xiàn)LTmRNA量下降。其中，與對(duì)照組相比，AdH1-siRNA/VEGF干擾后，VEGF的mRNA量下降為50％，而AdH1-siRNA/KDR干擾后，KDR的mRNA量下降為52％，AdH1-siRNA/FLT干擾后，F(xiàn)LT的mRNA量下降為40％。 2，三種干擾病毒AdH1-siRNA/VEGF，AdH-siRNA/

5、KDR，AdH1-siRNA/FLT對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖有干擾作用，以AdH1-siRNA/FLT最強(qiáng)。加入病毒9天后，對(duì)照組的細(xì)胞平均計(jì)數(shù)為31.5×10<'4>/ μl，空載病毒干擾組為28×10<'4>/μl，AdH1-siRNA/VEGF干擾組為21.5×10<'4>/μl，AdH1-siRNA/KDR干擾組為21×10<'4>/μl，AdH1-siRNA/FLT干擾組為16.25×10<'4>/μl。 3．三種干擾病

6、毒AdH1-siRNA/VEGF，Adn1-siRNA/KDR，AdH1-siRNA/FLT對(duì)HUVEC細(xì)胞在Matrigel上形成微血管均有干擾作用，對(duì)照組每HPF形成微血管數(shù)量為10.75條，空載病毒干擾組為10.25條，實(shí)驗(yàn)組以AdHl-siRNA/VEGF干擾作用最弱，每HPF形成微血管數(shù)量為7條，AdH1-siRNA/KDR次之，每HPF形成微血管數(shù)量為6條，其中以AdH1-siRNA/FLT作用最強(qiáng)，每HPF形成微血管數(shù)量為