RNA干擾介導(dǎo)抑制家蠶核型多角體病毒（BmNPV）增殖的研究.pdf

1、本文為了探討利用RNAi抑制病毒復(fù)制、增殖的效果，選取家蠶核型多角體病毒(BmNPV)對(duì)復(fù)制具有關(guān)鍵作用的極早期表達(dá)基因ie-1、解旋酶基因helicase以及對(duì)細(xì)胞釋放型病毒(CRV)水平傳播具有關(guān)鍵作用的病毒囊膜蛋白基因gp64為靶基因，體外合成了與其相對(duì)應(yīng)的dsRNA，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞，感染病毒粒子或共轉(zhuǎn)染病毒基因組DNA，研究比較了供試dsRNA對(duì)BmNPV復(fù)制、增殖的抑制效果，探討dsRNA分子大小以及同時(shí)抑制2個(gè)基

2、因表達(dá)對(duì)病毒滴度的影響，篩選最佳標(biāo)靶基因序列，為結(jié)合利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)和RNAi技術(shù)進(jìn)行家蠶抗病毒研究提供依據(jù)。主要研究?jī)?nèi)容如下： 一、ie-1基因相應(yīng)dsRNA對(duì)家蠶核型多角體病毒復(fù)制增殖的抑制研究。 根據(jù)BmNPV的ie-1基因序列，人工設(shè)計(jì)并體外合成了長(zhǎng)度為438bp的dsRNA，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，研究其對(duì)BmNPV復(fù)制增殖的抑制效果。結(jié)果表明該dsRNA能有效地抑制病毒DNA的復(fù)制，最大抑制效果是病毒滴度比對(duì)照

3、降低了104.3倍；1μgdsRNA與BmNPV基因組DNA轉(zhuǎn)染，處理區(qū)病毒增殖過(guò)程被完全抑制的有效作用時(shí)間是2d左右。 二、gp64基因相應(yīng)dsRNA對(duì)家蠶核型多角體病毒復(fù)制增殖的抑制研究。 根據(jù)BmNPV的gp64基因序列，人工設(shè)計(jì)并體外合成了分別位于gp64基因ORF前中后部的3個(gè)dsRNA片段G1、G2、G3(長(zhǎng)度分別為459、508、337bp)、以及G3片段進(jìn)一步截短細(xì)分的3個(gè)dsRNA小片段G3-1、G3-

4、2、G3-3(長(zhǎng)度分別為122、105、109bp)，用BmN培養(yǎng)細(xì)胞研究供試dsRNA對(duì)BmNPV增殖的抑制效果并進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明6個(gè)供試dsRNA都能有效地抑制病毒DNA的增殖，3個(gè)長(zhǎng)片段dsRNA的抑制效果沒(méi)有明顯差別，最大抑制效果為病毒滴度比對(duì)照降低了103.5倍左右，小片段dsRNA的抑制效果等于或高于大片段dsRNA。gp64基因相應(yīng)dsRNA的病毒滴度抑制效果在感染后24h、96h最高，呈雙峰型曲線，與推測(cè)的GP64

5、蛋白在早期與晚期都有表達(dá)相一致。 三、解旋酶基因相應(yīng)dsRNA對(duì)家蠶核型多角體病毒復(fù)制增殖的抑制研究。 根據(jù)BmNPV的解旋酶基因helicase的序列，體外合成了長(zhǎng)度為427bp的dsRNA，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞后研究其對(duì)BmNPV復(fù)制的抑制效果。結(jié)果表明該dsRNA能有效地抑制病毒DNA的復(fù)制，最大抑制效果為病毒滴度降低了102.92倍。 四、抑制不同靶基因?qū)倚Q核型多角體病毒增殖的抑制效果比較。 在

6、相同條件下，分別將ie-1、gp64、helicase的相應(yīng)dsRNA(I1、G3、H1)轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，研究各dsRNA對(duì)BmNPV增殖的抑制效果并進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明3個(gè)dsRNA對(duì)病毒復(fù)制、增殖的抑制效果的大小順序?yàn)镮1＞G3＞H1，認(rèn)為ie-1是利用RNAi技術(shù)抑制BmNPV復(fù)制增殖的最佳靶基因。利用dsRNA同時(shí)抑制ie-1、helicase2個(gè)基因與抑制單個(gè)基因進(jìn)行比較，表明同時(shí)抑制ie-1、gp642個(gè)基因的病毒滴度介于