液態(tài)基因芯片技術(shù)的建立及其在Y染色體微缺失檢測中的應(yīng)用.pdf

1、目的：影響男性不育的因素有很多，近年來的研究表明，Y染色體上存在著精子發(fā)生調(diào)控基因即無精子癥因子(azoospermia．factor,AZF)，其缺失引起的生精障礙是導(dǎo)致男性不育的重要原因，表現(xiàn)為原發(fā)性無精子癥(azoospermia)或少精子癥(oligospermia)。隨著對Y染色體微缺失研究的深入和細(xì)致，需要檢測的位點和基因越來越多，建立一套高效率的Y染色體微缺失多重PCR篩查系統(tǒng)，可以避免過多盼重復(fù)實驗，適應(yīng)臨床和科研需要。

2、目前大多數(shù)實驗室采用的多重PCR-電泳檢測方法在技術(shù)上仍存在易發(fā)生實驗室污染而使結(jié)果的可靠性降低的缺點；結(jié)果判斷時往往發(fā)現(xiàn)有些條帶模糊，因此易出現(xiàn)一些假陽性和假陰性結(jié)果。本實驗室建立多重PCR-液態(tài)基因芯片技術(shù)，用于檢測原發(fā)性無精癥和少精癥患者Y染色體AZF區(qū)域微缺失。并應(yīng)用所建立的液態(tài)基因芯片方法對原發(fā)性無精癥和少精癥患者及正常生育男性進(jìn)行Y染色體微缺失的分子檢測，驗證所建立的方法的可行性，確定無精癥和少精癥患者的缺失率，探討Y染色體

3、上部分生精基因的缺失與原發(fā)性無精癥和少精癥的關(guān)系及其分布規(guī)律。 方法：選取Y染色體長臂上的無精癥因子AZFa(sY84)、AZFb(sY127、sY134)、AZFc(sY254、sY255)三區(qū)共5個STS位點，并以男性特有的性別決定基因(sex determining region Y,SRY)的基因序列和12號染色體上的3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(G.APDH)的基因序列作為內(nèi)對照。正常男性、女性DNA分別為陽性對照、陰性對

4、照。利用PRIMER 5.0軟件分別設(shè)計出7對引物擴(kuò)增序列及檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的7條探針。建立多重PCR反應(yīng)體系、雜交反應(yīng)體系，對影響雜交反應(yīng)的因素做了分析。并用該技術(shù)對178例無精癥、134例少精癥患者和40例正常男性對照進(jìn)行Y染色體微缺失檢測。 結(jié)果： 1、建立sY14(SRY)、sY84、sY127、sY134、sY254、sY255、GAPDH7重PCR反應(yīng)體系。 2、建立七重PCR-液態(tài)基因芯片技術(shù)，并

5、對液態(tài)基因芯片技術(shù)應(yīng)用于檢測Y染色體AZF區(qū)域微缺失的重復(fù)性做了研究性分析，結(jié)果顯示，變異系數(shù)(CV％)范圍在2.2％～7.8％之間。 3、312例無精癥、少精癥患者中，40例有AZF區(qū)域STS位點或基固的缺失，總?cè)笔蕿?2.8％。178例無精癥患者中，25例出現(xiàn).AZF位點缺失，缺失率為14％；114例少精癥和20例嚴(yán)重少精癥患者中，分別有11例(9.6％)和4例(20％)出現(xiàn)AZF位點缺失。在40例缺失患者中，19例為.A

6、ZFc區(qū)域缺失，13例為AZFa和4例AZFb區(qū)域缺失。另外，有4例患者同時缺失AZFb和AZFc。 4、對照組中未發(fā)現(xiàn)缺失，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，實驗組與對照組缺失率有顯著性差異(X<'2>=5.788，P<0.05)。 結(jié)論： 1、運用液態(tài)基因芯片技術(shù)檢測Y染色體微缺失，具有高通量、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、快速簡便、自動化等優(yōu)點，與多重PCR相結(jié)合使對無精癥和少精癥的診斷更加準(zhǔn)確、可靠。 2、Y染色體微