LPA對豬孤雌胚胎早期發(fā)育及多能性標(biāo)志基因的影響.pdf

1、豬作為中國的大家畜，對中國的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展起著重要的作用。目前來說獲得豬多能干細(xì)胞的主要方法是通過體外分離和重編程，但是存在的主要問題都是沒有獲得“naive”狀態(tài)的豬ES細(xì)胞。為了進(jìn)一步促進(jìn)豬胚胎早期發(fā)育，獲得更利于分離培養(yǎng)獲得naive多能性狀態(tài)的胚胎干細(xì)胞(ES)的囊胚材料，在本實(shí)驗(yàn)探討Lysophosphatidic acid(LPA)對豬孤雌胚胎早期發(fā)育以及相關(guān)多能性基因表達(dá)的影響并對其信號通路進(jìn)行了初步探討。以期為下一步分離獲

2、得豬ES獲得良好的材料。研究結(jié)果總結(jié)如下:1.LPA(Lysophosphatidic acid)對豬孤雌胚胎早期發(fā)育以及相關(guān)胚層的影響。首先對LPA作用的濃度進(jìn)行探索，從囊賠率、卵裂率以及囊胚細(xì)胞數(shù)來看，發(fā)現(xiàn)50μM的LPA處理濃度要顯著優(yōu)于其他處理組，并且囊胚質(zhì)量也優(yōu)于對照組。為了進(jìn)一步確認(rèn)前面的試驗(yàn)結(jié)果，從蛋白水平選用了OCT4抗體進(jìn)行了免疫熒光染色，結(jié)果顯示，50μM的LPA處理濃度免疫熒光強(qiáng)度也優(yōu)于其他實(shí)驗(yàn)組和對照組，所以確定

3、了50μM的LPA處理濃度進(jìn)行了后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。隨后探索了LPA對原始內(nèi)胚層、原始外胚層以及滋養(yǎng)層標(biāo)志基因的影響。QRT-PCR結(jié)果顯示:LPA對原始外胚層標(biāo)志基因沒有顯著影響，但是LPA可以顯著上調(diào)滋養(yǎng)層標(biāo)志基因的表達(dá)并且可以極顯著地下調(diào)原始內(nèi)胚層標(biāo)志基因的表達(dá)。以上結(jié)果表明，LPA可以促進(jìn)早期豬孤雌囊胚的發(fā)育，并且對豬早期胚胎原始內(nèi)胚層有著重要的影響。2.LPA作用于豬孤雌胚胎相關(guān)信號通路的探索。首先探索FGF信號通路對豬孤雌胚胎原始內(nèi)

4、胚層的影響，QRT-PCR結(jié)果顯示:30ng/mL的bFGF可以顯著上調(diào)豬囊胚原始內(nèi)胚層GATA4基因。在同時添加LPA和bFGF后，豬囊胚原始內(nèi)胚層標(biāo)志基因GATA4和單獨(dú)添加LPA時結(jié)果一致，即GATA4基因顯著下降。隨后探索LPA是否通過ROCK信號通路起作用。使用ROCK信號通路抑制劑Y27632抑制ROCK信號通路表達(dá)以后再添加LPA后，豬囊胚原始內(nèi)胚層標(biāo)志基因GATA4沒有顯著變化。以上結(jié)果表明，與小鼠早期胚胎一樣，F(xiàn)GF信

5、號通路任然可以調(diào)節(jié)豬的原始內(nèi)胚層的發(fā)育，而LPA主要通過ROCK信號通路對豬原始內(nèi)胚層起作用，并且作用強(qiáng)度可能大于FGF信號通路。3.為了更進(jìn)一步的研究LPA對豬早期囊胚發(fā)育中多能性基因表達(dá)的影響，對“naive”和“primed”兩類候選基因進(jìn)行了定量測定，結(jié)果顯示:LPA對“naive”態(tài)基因沒有顯著影響，但是能顯著下調(diào)“primed”多能基因NODAL和Activin-A的表達(dá)，并且能顯著提高ES細(xì)胞自我更新因子OCT4和c-My