M-,3--G-,11α-融合蛋白在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)及特異性配體的篩選.pdf

1、毒蕈堿型乙酰膽堿受體(MACHR)，簡(jiǎn)稱M受體，是G—蛋白藕聯(lián)受體家族(GPCR)的成員之一，在與相應(yīng)的配體結(jié)合后，與G—蛋白相藕聯(lián)，介導(dǎo)激素、神經(jīng)遞質(zhì)等細(xì)胞外界因素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而引起細(xì)胞的功能及活動(dòng)，調(diào)節(jié)神經(jīng)信號(hào)的傳遞、認(rèn)知記憶、心血管活動(dòng)、腺體分泌、平滑肌收縮等多種生理功能。分子生物學(xué)上根據(jù)克隆的五種不同編碼的基因?qū)受體分為五個(gè)亞型，即m1—m5；藥理學(xué)上將M受體根據(jù)其相應(yīng)的特異性激動(dòng)劑與拮抗劑分為M1—M4四種亞型。其中m1、

2、m2、m3、m4分別對(duì)應(yīng)于M1、M2、M3、M4，m5受體亞型未找到與之相對(duì)應(yīng)的藥理學(xué)分型。各種亞型的基本結(jié)構(gòu)相似，主要差別在于胞漿內(nèi)3環(huán)的不同，這決定了它們的功能的不同。 M3受體亞型廣泛分布于中樞及周圍組織中，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，如大腦中存在m1—m5各種亞型。在外周組織中，M3受體廣泛分布于胃腸道平滑肌、膀胱逼尿肌、心肌及各種腺體中。M受體是G蛋白藕聯(lián)受體家族的一員，具有該家族特征性的結(jié)構(gòu)。七個(gè)跨膜區(qū)，三個(gè)膜內(nèi)環(huán)和三個(gè)膜外環(huán)

3、以及位于胞外的N端及位于胞內(nèi)的C端。五個(gè)mACHR亞型蛋白分子量約51—66KD，由460-590個(gè)氨基酸殘基組成，N端在膜外，C端在膜內(nèi)，它七次穿過(guò)細(xì)胞膜，組成七個(gè)跨膜疏水區(qū)(Tm1—7)，三個(gè)膜外環(huán)(O1—3)和三個(gè)膜內(nèi)環(huán)(i1—3)，五個(gè)亞型的跨膜區(qū)Tm1—7比較相似，膜外的三個(gè)環(huán)袢O1—3及i1—2在亞型間也比較保守，但N端，C端及i3環(huán)變異較大，i3環(huán)在胞漿內(nèi)形成一個(gè)柱狀的α螺旋結(jié)構(gòu)，M受體就是在此與G蛋白結(jié)合而引起的一系列生

4、理、生化反應(yīng)。M受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程由受體、傳導(dǎo)體(G—蛋白)、效應(yīng)器三部分組成。G蛋白處于非活化狀態(tài)時(shí)，G蛋白以異三聚體形式存在于細(xì)胞膜上，α亞基與GDP結(jié)合，與βγ異二聚體結(jié)合在一起。 當(dāng)激動(dòng)劑與M受體結(jié)合時(shí)，M受體蛋白分子空間構(gòu)象發(fā)生改變，與G蛋白α亞單位相接觸，α亞基與GTP結(jié)合，與βγ亞基解離，Gα—GTP和Gβγ能分別作用于效應(yīng)蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的效應(yīng)蛋白的生物學(xué)活性，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)外的信號(hào)傳遞。當(dāng)M受體與激動(dòng)劑結(jié)合的信

5、號(hào)解除時(shí)，完成了信號(hào)傳遞作用的α亞單位同時(shí)具備了GTP酶活性，分解GTP，生成GDP，與效應(yīng)蛋白分離，再與βγ亞基結(jié)合，重新形成非活性的G蛋白三聚體。 根據(jù)組成的G蛋白的α亞單位的結(jié)構(gòu)與活性，目前已知的G蛋白被分為Gs家族，Gq家族，Gi/o家族和G12/13家族。目前發(fā)現(xiàn)有21種α亞基，6種β亞基和12種γ亞基，形成多種特異性結(jié)合。 五種亞型的M受體因與G蛋白藕聯(lián)的機(jī)制不同分為兩組：調(diào)節(jié)PIP3水解類的M1組(M1、M

6、3、M5)和抑制腺苷酸環(huán)化酶活性類的M2組(M2、M4)，M3受體與Gq/11蛋白藕聯(lián)，受體的激活引起G蛋白三聚體解離，α亞單位與GTP結(jié)合，激活磷脂酶C(PLC)，第二信使三磷酸肌醇(IP3)和甘油二酯(DG)合成增多，引起細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放，細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增加，進(jìn)而引起蛋白激酶C(PKC)、腺苷酸環(huán)化酶(AC)、磷酸二酯酶(PDE)、鈣調(diào)素(CAM)等活性的改變。 本研究以M3和G11α為研究對(duì)象觀察M受體與G蛋白的藕聯(lián)關(guān)系。采用

7、PCR技術(shù)將編碼M3受體與G11α蛋白的CDNAS進(jìn)行連接并重組到PBacPAK9病毒載體內(nèi)，通過(guò)病毒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，可以獲得細(xì)胞膜上大量表達(dá)的M3受體與G11α蛋白的融合蛋白，本研究以這種高效藕聯(lián)的M3—G11α融合蛋白為研究對(duì)象，檢測(cè)在不同配體作用下，M3—G11α融合蛋白的表達(dá)和功能的變化，探討信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中分子間相互作用的機(jī)制和影響因素。 材料與方法: 一、材料 M3擴(kuò)增引物M3BamH1和M3—C末，G1

8、1α擴(kuò)增引物M3—G11α和G11α—SalⅠ，pBacPAK9，T4連接酶，Taq聚合酶，BmaHⅠ限制性內(nèi)切酶，SalⅠ限制性內(nèi)切酶，dNTP等受贈(zèng)于日本東京大學(xué)醫(yī)學(xué)部神經(jīng)生化教研室。PCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)于寶生物公司。BCA法測(cè)定膜蛋白濃度試劑盒購(gòu)于凱基公司。Sf9昆蟲細(xì)胞株受贈(zèng)予北京大學(xué)生命科學(xué)院陳建國(guó)教授；TNM—FH昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)于Sigma公司；胎牛血清購(gòu)于TBD公司；放射性配體[3H]QNB、[35S]GTPγs購(gòu)于Ame

9、rsham Pharmacia Biotech公司，乙酰膽堿、卡巴膽堿、匹魯卡品、MCN—A343、4—damp、阿托品、GDP、達(dá)菲那新等購(gòu)于Sigma公司。 二、方法 應(yīng)用PCR擴(kuò)增編碼M3和G11α的目的cDNA片段，電泳檢測(cè)目的cDNA片段的結(jié)構(gòu)，用“ultracleanTM15 DNA purification kit from gel and solution”方法純化目的cDNA。應(yīng)用第二次PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)編

10、碼M3的cDNA與編碼G11α的cDNA進(jìn)行連接，并擴(kuò)增連接體，電泳檢測(cè)連接的結(jié)果并純化，將純化后的cDNA片段應(yīng)用限制性內(nèi)切酶連接到病毒載體中。構(gòu)建pBacPAK9—M3—G11α重組蛋白的表達(dá)載體，Baculovirus—sf9—cell表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)M3—G11α融合蛋白。用BCA蛋白分析方法測(cè)定膜蛋白的總濃度；用[3H]QNB做放射性配體飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)，測(cè)定融合蛋白的表達(dá)水平；用[35S]GTPγS做放射性配體競(jìng)爭(zhēng)性替代結(jié)合實(shí)驗(yàn)，檢

11、測(cè)在激動(dòng)劑或拮抗劑作用下M3受體與G11α相互作用的分子機(jī)制及其影響因素，篩選亞型特異性的激動(dòng)劑或拮抗劑。 結(jié)果: 通過(guò)PCR方法成功的擴(kuò)增了編碼M3受體亞型與G11α亞基的cDNA，再通過(guò)二次PCR實(shí)現(xiàn)了編碼M3受體亞型與G11α亞基的cDNA的重組連接，并應(yīng)用限制性內(nèi)切酶實(shí)現(xiàn)了編碼M3—G11α的cDNA與病毒載體Pbacpak9的連接，并在Sf9細(xì)胞中成功的表達(dá)了M3—G11α的融合蛋白。接種病毒載體的Sf9細(xì)胞腫

12、脹變大，大小不均，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后收獲細(xì)胞，提取病毒載體及細(xì)胞沉淀。從細(xì)胞沉淀中經(jīng)消化、研磨、離心方法提取膜蛋白，BCA方法測(cè)定膜蛋白含量為2.86mg/ml，[3H]QNB放射性配體飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，M3—G11α融合蛋白具有與[3H]QNB特異性的、高水平的結(jié)合位點(diǎn)，隨著[3H]QNB放射性配體濃度的升高，融合蛋白與[3H]QNB的結(jié)合量逐漸增加，具有M受體與配體結(jié)合的特性，當(dāng)[3H]QNB濃度為約6nmol/L時(shí)

13、，基本達(dá)到飽和，表達(dá)水平為7.76nmol/g，融合蛋白具有M受體與配體高度親和力的特性，在10umol/LGTPγS存在的條件下，融合蛋白與[3H]QNB放射性配體結(jié)合的飽和結(jié)合曲線明顯下移，此時(shí)在達(dá)到飽和時(shí)測(cè)得的融合蛋白表達(dá)水平為3.92nmol/g，提示GTPγS通過(guò)與G蛋白的α亞單位結(jié)合，降低了非選擇性M受體阻斷劑QNB與M3受體的親和力，反映出融合蛋白兩組分間的藕聯(lián)能力，可用于檢測(cè)M3與G11α相互作用和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及影響因素

14、的研究。[35S]GTPγS結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乙酰膽堿(Ach)、匹魯卡品(Pilo)為M3受體的完全激動(dòng)劑；卡巴膽堿(Cch)、MCN—A—343為M3受體的部分激動(dòng)劑；阿托品(Atro)、4—Damp、達(dá)菲那新(Dafi)為M3受體的阻斷劑。 討論： 近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，為研究M受體亞型及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)提供了新的途徑。本研究以高效藕聯(lián)的M3—G11α融合蛋白為研究對(duì)象，檢測(cè)在不同的配體作用下，M3—G11α融合

15、蛋白的表達(dá)和功能的變化，探討信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中分子間相互作用的機(jī)制和影響因素，篩選M3受體亞型特異性配體。 放射性配體[35S]GTPγS競(jìng)爭(zhēng)性替代結(jié)合實(shí)驗(yàn)是研究G蛋白藕聯(lián)受體特異性配體的敏感方法。在GDP替代[35S]GTPγS結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，在不同的配體、不同濃度GDP存在時(shí)，[35S]GTPγS競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合作用的變化表明不同配體可以引起替代結(jié)合曲線偏移的方向和幅度不同，這種偏移代表了M3—G11α融合蛋白中的G11α亞基與GDP的親和力

16、的大小，當(dāng)M3受體被激動(dòng)劑激動(dòng)時(shí)會(huì)引起與之藕聯(lián)的G蛋白的構(gòu)象變化，降低了G蛋白α亞基與GDP的親和力，使GDP容易從G蛋白α亞基上解離下來(lái)；當(dāng)M3受體被阻斷劑阻斷時(shí)會(huì)引起與之藕聯(lián)的G蛋白的構(gòu)象變化，增加了G蛋白α亞基與GDP的親和力，使GDP難以從G蛋白的α亞基上解離下來(lái)。即激動(dòng)劑作用受體時(shí)，G蛋白α亞基與GDP的親和力最小，部分激動(dòng)劑次之，阻斷劑更次之，而受體反向激動(dòng)劑與受體結(jié)合時(shí)α亞基與GDP的親和力最大。因此，通過(guò)分析GDP與M3

17、—G11α融合蛋白親和力的大小可以篩選和鑒定M3受體未知的特異性完全激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑、拮抗劑和反向激動(dòng)劑。 M3—G11α融合蛋白表達(dá)為研究M3受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制提供了便利條件，同時(shí)也為篩選M3受體亞型特異性配體提供了可能性，為M3受體亞型特異性藥物開(kāi)發(fā)和研制提供了有力的實(shí)驗(yàn)手段。 結(jié)論: 桿狀病毒—sf9細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)的M3—G11α融合蛋白具有與配體結(jié)合的特性及組分間藕聯(lián)的能力，配體通過(guò)改變M3—G11α融合