肌肉特異性酪氨酸激酶-紅色熒光蛋白融合熒光蛋白在HEK293細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、目的：將構(gòu)建好的肌肉特異性酪氨酸激酶（MuSK）-紅色熒光蛋白（mCherry）融合蛋白（MuSK-mCherry）基因，轉(zhuǎn)染在人胚腎HEK293細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，為后續(xù)檢測(cè)重癥肌無(wú)力患者（MG）MuSK抗體制備抗原。
　　方法：將轉(zhuǎn)化有pMT/BiP/V5-His（MuSK–mCherry）的E coli DH5α擴(kuò)大培養(yǎng)，提取出質(zhì)粒，電泳后置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察其位置確認(rèn)是否含有pMT/BiP/V5-His（MuSK–mCher

2、ry）質(zhì)粒。分別在放有爬片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板和普通6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)人胚腎HEK392細(xì)胞，將提取出的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人胚腎HEK293細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后取放有爬片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板第24小時(shí)的細(xì)胞，通過(guò)抗熒光猝滅封片劑封片，凝固后應(yīng)用共聚焦顯微鏡在激發(fā)波長(zhǎng)為587 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為610 nm處觀察熒光圖像確認(rèn)轉(zhuǎn)染表達(dá)的情況。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)內(nèi)每6個(gè)小時(shí)為一時(shí)間將轉(zhuǎn)染后的普通6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞提取凍存為細(xì)胞團(tuán)。將細(xì)胞團(tuán)統(tǒng)一進(jìn)行細(xì)胞裂解提取出蛋

3、白后，應(yīng)用免疫印跡檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)表達(dá)的融合蛋白，觀察條帶確認(rèn)細(xì)胞表達(dá)情況及轉(zhuǎn)染后每個(gè)時(shí)間段的表達(dá)差異。
　　結(jié)果：通過(guò)電泳檢測(cè)于E coli DH5α中提取出的質(zhì)粒溶液在凝膠成像系統(tǒng)中觀察，發(fā)現(xiàn)5647bp大小條帶，與理論條帶位置符合。在HE293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染后通過(guò)免疫熒光圖像觀察到有紅色熒光蛋白，于每6小時(shí)的細(xì)胞團(tuán)中提取的蛋白進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)，可觀察到72.4KDa大小條帶，與理論條帶位置符合，并觀察到轉(zhuǎn)染后每個(gè)時(shí)間段的表達(dá)有差異。