NDV7793-HN蛋白在SF9細胞中的表達.pdf

1、研究背景及目的:新城疫病毒(NDV)屬于禽類病毒，能引起禽類大面積的死亡，給家禽業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。NDV病毒對人類基本不致病，但能殺死腫瘤細胞，已被用于抗腫瘤的生物治療上。2006年以來課題組利用從江西省鄱陽湖野鴨分離得到的1株NDV7793弱毒株進行NDV抗腫瘤治療的系列研究，積累了大量NDV抗腫瘤生物治療基礎(chǔ)研究的經(jīng)驗。為了能更深入進行研究，擬利用真核表達基因工程系統(tǒng)對NDV的表面蛋白進行表達和純化。
　　NDV含有多種蛋

2、白，其中的血凝素神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)是固定在病毒囊膜外表面上的蛋白，具有血凝素和神經(jīng)氨酸酶的功能，在病毒侵染細胞的過程中，HN起到識別細胞膜表面的唾液酸受體和介導(dǎo)病毒吸附細胞膜的作用。HN不僅是NDV引起禽類致病的主要蛋白，而且在NDV發(fā)揮抗腫瘤功能上起至關(guān)重要的作用，研究HN蛋白的功能有重要意義。為了獲得高品質(zhì)的HN蛋白進行深入的研究，將利用昆蟲細胞——草地貪夜蛾卵巢細胞系(SF9)來表達NDV7793HN蛋白，這是實驗室第一次利用

3、SF9細胞表達NDV7793弱毒株的HN蛋白。
　　方法:
　　1.提取NDV7793的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過PCR將HN基因進行點突變，并將NcoⅠ/XhoⅠ酶切位點引入NDV7793HN基因片段。
　　2.將HN基因片段通過酶切和連接的方法連接到pFastBac1 HT B質(zhì)粒載體，以構(gòu)建pFastBac1 HT B-HN重組質(zhì)粒，將質(zhì)粒送測序公司進行測序。
　　3.將測序正確的pFastBac1 H

4、T B-HN重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞DH10Bac TM中，提取H N桿粒，PCR驗證HN桿粒。
　　4.用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將HN桿粒轉(zhuǎn)入進昆蟲SF9細胞中，培養(yǎng)48小時后收取細胞培養(yǎng)上清，獲得第一代病毒，接著用一代病毒感染SF9細胞，培養(yǎng)60小時后收取細胞培養(yǎng)上清，獲得二代病毒，最后用二代病毒感染SF9細胞，培養(yǎng)72小時后收集細胞，用SDS-PAGE檢測HN蛋白的表達。
　　結(jié)果:
　　1.從NDV7793病毒中提取出

5、了病毒的RNA，RNA逆轉(zhuǎn)錄成了cDNA，PCR擴增出1710bp帶有NcoⅠ/XhoⅠ酶切位點的HN基因片段。
　　2.測序結(jié)果表明:pFastBac1 HT B-HN質(zhì)粒構(gòu)建成功，HN中的XhoⅠ酶切位點被去除。
　　3.從DH10BacTM細胞其取出HN桿粒，PCR驗證HN桿粒構(gòu)建成功。
　　4.SDS-PAGE結(jié)果顯示在HN桿粒感染的SF9細胞裂解液中比未感染病毒的SF9細胞裂解液在67kDa左右出現(xiàn)了一個明顯