結(jié)直腸癌中腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因Kiss-1啟動(dòng)子甲基化的相關(guān)研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分
　　目的：
　　1、檢測(cè)結(jié)直腸正常組織、腺瘤、結(jié)直腸癌旁組織、結(jié)直腸癌組織Kiss-1基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率，分析其在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用。
　　2、檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中Kiss-1基因表達(dá)量的差異，分析其與結(jié)直腸癌臨床病理特性的關(guān)系。
　　3、檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中Kiss-1基因啟動(dòng)子甲基化水平，分析其與結(jié)直腸癌臨床病理特性的關(guān)系及其臨床意義。
　

2、　方法：
　　1、采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)法（MSP）檢測(cè)結(jié)直腸癌組織、癌旁組織、結(jié)直腸腺瘤、正常結(jié)直腸組織中Kiss-1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)。
　　2、應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（realtime-PCR）檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因Kiss-1基因mRNA表達(dá)水平。
　　3、應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法（wers te n-b lot）檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中K is s-1基因蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：

3、r>　　1、結(jié)直腸癌組織中Kiss-1基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率為82.2％(60/73)，癌旁組織30.0%(22/73)，結(jié)直腸腺瘤組織21.7%(5/23)，正常結(jié)直腸組織6.3%(9/142)，四者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　2、結(jié)直腸癌組織中Kiss-1基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率低分化組高于高分化組(90.5%VS60%)，T3+T4組高于T1+T2組(98.1%VS35.0%)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組

4、(93.3%VS74.4%)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組(100%VS87.3%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；結(jié)直腸癌組織K is s-1基因甲基化水平與性別、年齡、腫瘤部位及瘤體大小無關(guān)(P>0.05)。
　　3、測(cè)定結(jié)直腸癌組織中Kiss-1基因mRNA的表達(dá)量，Kiss-1基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性組低于陰性組(0.240±0.036VS1.138±0.136，P<0.05)；結(jié)直腸癌組織Kiss-1基因mRNA表達(dá)量差異

5、與腫瘤分化、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。結(jié)直腸癌組織K iss-1基因mRNA相對(duì)表達(dá)量與性別、年齡、腫瘤部位及瘤體大小無關(guān)(P>0.05)。
　　4、測(cè)定結(jié)直腸癌組織中Kiss-1基因蛋白質(zhì)表達(dá)量，Kiss-1基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性組（0.388±0.032）顯著低于甲基化陰性組（0.945±0.050）（P<0.05）。結(jié)直腸癌組織中Kiss-1基因蛋白質(zhì)表達(dá)差異與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<

6、0.05)。同樣，K is s-1基因目的蛋白表達(dá)量與患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分化及部位無關(guān)（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、Kiss-1基因啟動(dòng)子甲基化是結(jié)直腸癌常見的表觀遺傳學(xué)修飾方式之一，可能與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)和分化等特性密切相關(guān)；
　　2、結(jié)直腸癌組織中Kiss-1基因表達(dá)水平可能受到K iss-1基因啟動(dòng)子甲基化水平的調(diào)控；
　　3、Kiss-1基因甲基化水平有可能成為評(píng)估結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移

7、風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后的指標(biāo)之一。
　　第二部分
　　目的：
　　1、分析不同人結(jié)直腸癌細(xì)胞株中Kiss-1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與Kiss-1基因mRNA、表達(dá)蛋白metastin水平之間的關(guān)系，研究Kiss-1基因甲基化對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響。
　　2、研究5-雜氮-2'-脫氧胞苷（5-Aza-CdR）對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116的Kiss-1基因啟動(dòng)子甲基化以及Kiss-1基因表達(dá)的影響。
　　3、研究5

8、-Aza-CdR作用結(jié)直腸癌細(xì)胞HC T116的侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性的影響，探討是否能夠通過逆轉(zhuǎn)Kiss-1基因啟動(dòng)子甲基化的方式改變結(jié)直腸癌的生物學(xué)特性。
　　方法：
　　1、分別應(yīng)用甲基化特異性PCR（MSP）、實(shí)時(shí)定量PCR法（Realtime-PCR）和免疫印跡法（Western-blot）檢測(cè)人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116、SW480、SW1116、VOLO中Kiss-1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)、Kiss-1基因mRNA

9、表達(dá)水平和metastin表達(dá)水平；Transwell小室檢測(cè)人結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移能力。
　　2、應(yīng)用不同濃度（0、0.1、1、5、10umol/L）的5-Aza-CdR作用HCT116細(xì)胞，分別于24小時(shí)、3天和5天后檢測(cè)Kiss-1基因啟動(dòng)子甲基化水平、Kiss-1基因mRNA和metastin的表達(dá)變化情況；
　　3、應(yīng)用Cell Counting Kit-8（CCK-8）檢測(cè)細(xì)胞增殖能力、Transwell小室檢

10、測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移能力的變化。
　　結(jié)果：
　　1、HCT116、SW116及SW480細(xì)胞中Kiss-1基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性，LoVo細(xì)胞甲基化陰性；定量分析Kiss-1基因mRNA和metastin表達(dá)量，結(jié)果顯示Lo Vo>SW480>SW1116>HC T116（p<0.05）。SW480、Vo Lo細(xì)胞的增殖能力低于HCT116組（p<0.05），SW1116、SW480、VoLo細(xì)胞侵襲能力均低于HCT116組（p

11、<0.05），SW480、Vo Lo細(xì)胞遷移能力均低于HCT116組（p<0.05）。
　　2、各劑量組在5-Aza-CdR干預(yù)HC T116細(xì)胞24h、3天及5天后，均呈現(xiàn)Kiss-1基因mRNA表達(dá)量較對(duì)照組明顯增加（p<0.05），并呈時(shí)間依賴性。5-Aza-CdR干預(yù)HCT116細(xì)胞24h后，5umol/L和10umol/L組Kiss-1基因mRNA表達(dá)量較對(duì)照組有明顯增高（P<0.05）；3天后，除0.1umol/L組外

12、，各組均有較對(duì)照組有明顯增高（P<0.05）；5天后，各個(gè)濃度處理組Kiss-1基因mRNA表達(dá)量均較對(duì)照組有明顯增高（P<0.05），但10umol/L組與5umo l/L組相比較無明顯增加（P>0.05）。
　　3、不同劑量5-Aza-CdR干預(yù)HCT116細(xì)胞5天后，各濃度組metastin表達(dá)量較對(duì)照組有明顯增高（P<0.05），但10umo l/L組與5umo l/L組無明顯差異（P>0.05）。5umol/L濃度5-A

13、za-CdR干預(yù)HCT116細(xì)胞，與對(duì)照組相比較，24h、3天和5天K iss-1基因metastin表達(dá)量明顯升高，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量逐漸升高（P<0.05），呈時(shí)間依賴性。
　　4、各劑量組與對(duì)照組比較，24h、3天中10umo l/L組對(duì)HCT116細(xì)胞增殖能力具有明顯抑制作用（P<0.05）；5天中各濃度組對(duì)HCT116細(xì)胞增殖能力均有明顯抑制作用，隨著劑量的增加的延長(zhǎng)，其抑制率增加（P<0.05），且呈濃度依賴性。

14、
　　5、同一劑量組5-Aza-CdR干預(yù)HCT116細(xì)胞24h、3天、5天后，HCT16細(xì)胞的侵襲能力均較對(duì)照組明顯下降（P<0.05），且呈時(shí)間依賴性。5-Aza-CdR干預(yù)HC T116細(xì)胞24小時(shí)后，10umol/L組細(xì)胞侵襲能力較對(duì)照組明顯下降（P<0.05）；干預(yù)3天和5天后，4個(gè)劑量組細(xì)胞的侵襲能力均較對(duì)照組均明顯下降（P<0.05），且呈濃度依賴性。
　　6、同一劑量組5-Aza-CdR干預(yù)HCT116細(xì)胞2

15、4h、3天、5天后，各劑量組細(xì)胞遷移能力較對(duì)照組均有明顯下降（P<0.05），且呈時(shí)間依賴性。5-Aza-CdR干預(yù)HC T116細(xì)胞24小時(shí)后，10umol/L組細(xì)胞遷移能力較對(duì)照組明顯下降（P<0.05）；干預(yù)3天和5天后，4個(gè)劑量組細(xì)胞的遷移能力均較對(duì)照組均明顯下降（P<0.05），且呈濃度依賴性。
　　結(jié)論：
　　1、Kiss-1基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化可能是結(jié)直腸癌細(xì)胞中Kiss-1基因表達(dá)下調(diào)的原因之一，且與結(jié)直腸