DNA甲基轉移酶1在結直腸癌DNA甲基化中作用機制的研究.pdf

1、目的：
　　結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是消化道常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率高居各種惡性腫瘤第三位，在腫瘤致死的病因中居第四位。2008年全球新增癌癥患者1270萬人，其中絕大部分發(fā)生在發(fā)展中國家。結直腸癌發(fā)病率和死亡率居高不下的原因之一就是缺乏行之有效的早期檢測和治療方法。近年來隨著表觀遺傳學的興起，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化不僅參與體內多種重要的生理過程，而且在眾多腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用，被公認為是腫瘤常

2、見的表觀遺傳學改變之一。介于腫瘤相關的甲基化事件有望成為結直腸癌防治中的重要分子靶標，因此，深入探討DNA甲基化與結直腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，對于尋求結直腸癌的臨床早期診斷、治療和預防的新途徑都具有重要的指導意義。
　　基于上述研究現(xiàn)狀，本研究擬從DNMT1切入，首先檢測DNMT1和T-cadherin蛋白在人結直腸癌組織和相應癌旁組織的表達情況，分析結直腸癌及癌旁組織中DNMT1和T-cadherin蛋白表達水平與臨床和病理的

3、相關性。進一步在基因水平上探討人結直腸癌組織中DNMT1mRNA的表達和T-cadherin的甲基化狀況，分析其與結直腸癌發(fā)生發(fā)展的關系。接著用技術，檢測DNMT1siRNA干擾對結直腸癌細胞株DNMT酶活性的作用，明確DNMT1siRNA對結直腸癌DNA甲基化水平的影響。最后探討DNMT1siRNA靶向性沉默DNMT1基因對結腸癌細胞凋亡及其相關基因CDNK1A、T-cadherin、Bcl-2和Bax的mRNA表達的影響，明確DNM

4、T1siRNA對結腸癌細胞凋亡影響的分子機制。
　　方法:
　　1.收集2009年10月到2011年1月湘雅二醫(yī)院手術切除的36例結直腸癌患者的結直腸癌組織和相應的癌旁組織，同時收集患者臨床資料，所有病例確診為腺癌。采用鏈霉素抗生物素-過氧化酶(SP)免疫組織化學法檢測結直腸癌和相應癌旁組織中DNMT1和T-cadherin蛋白表達，DNMT1在細胞核染色判定為陽性，T-cadherin在細胞膜染色判定為陽性。每張切片在高倍

5、鏡視野下，隨機計數(shù)至少500個細胞，計算陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分率。
　　2.RT-PCR檢測DNMT1基因mRNA表達情況，利用甲基化特異性PCR方法檢測T-cadherin基因啟動子區(qū)甲基化狀況，分析結直腸癌中DNMT1mRNA的表達與T-cadherin基因啟動子甲基化狀況及兩者之間的相關性。
　　3.采用脂質體法DNMT1siRNA瞬時轉染人結腸癌HT-29細胞，實驗分為空白對照組、陰性siRNA（15nM）組、陰

6、性siRNA(31nM)組、DNMT1siRNA（15nM）組、、DNMT1siRNA(30nM)組，轉染48小時候收集細胞，分別提取DNA、總RNA和蛋白質（共5組），RT-PCR檢測DNMT1基因mRNA的表達情況，WB檢測DNMT1蛋白的表達情況，DNMT酶活性檢測試劑盒檢測瞬時轉染對酶活性的影響。
　　4.采用脂質體法DNMT1siRNA瞬時轉染人結腸癌HT-29細胞，實驗分為空白對照組、陰性siRNA（15nM）組、陰性

7、siRNA(31nM)組、DNMT1siRNA（15nM）組、、DNMT1siRNA（30nM）組，轉染48小時收集細胞，轉染48小時候，MTT法測定各組結腸癌細胞的增殖情況，流式檢測細胞周期和凋亡情況，采用RT-PCR檢測DNMT1siRNA干擾對基因CDNK1A、T-cadherin、Bcl-2和Bax的mRNA水平的影響。
　　結果:
　　1.免疫組化研究顯示，T-cadherin分子的表達位于細胞膜，呈棕黃色。閱片結

8、果顯示T-cadherin在結直腸癌組織及非癌性結直腸癌組織中的陽性表達率分別為38.89％(14/36)、100％(36/36)，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。DNMT1分子的表達位于細胞核，亦呈棕黃色。閱片結果顯示在結直腸癌組織中的陽性表達率69.44％(25/36)，高于非癌性結直腸癌組織11.11％(4/36)，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。T-cadherin蛋白表達與結直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤大小

9、無關，組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表1-1），但其與腫瘤的分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及Dukes分期有關，且分別與腫瘤的分化程度和Dukes分期呈負相關。DNMT1蛋白表達與結直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤大小和分化程度無關，組間差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，表1-2)，但其與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移和腫瘤分期有關，且與Dukes分期呈正相關。
　　2.結直腸癌組織DNMT1mRNA的2-△△ct均值為2.72±0

10、.48，癌旁組織的2-△△ct均值為1.44±0.49，前者明顯高于后者(P＜0.05)。結直腸癌組織的甲基化比例高達73.73％±31.24％，癌旁組織的甲基化比例為44.25％±28.01％，前者明顯高于后者，(P＜0.05)。結直腸癌組織中的DNMT1mRNA表達量與T-cadherin基因啟動子甲基化構成比呈正相關(rs=0.875，P=0.001)。
　　3.瞬時干擾后，Western blot結果顯示DNMT1siRN

11、A（15nM）組和DNMT1siRNA(30nM)組的DNMT1蛋白表達量明顯低于空白對照組、陰性siRNA（15nM）組和陰性siRNA（30nM）組，且以DNMT1siRNA（30nM）組最低。4組中實驗組的DNMT酶活性的抑制率均高于空白對照組(P＜0.05); DNMT1siRNA(15nM)組和DNMT1siRNA(30nM)組的抑制率分別高于陰性siRNA(15nM)組和陰性siRNA(30nM)組(P＜0.05)，且以DN

12、MT1siRNA(30nM)組最高。RT-PCR結果顯示DNMT1siRNA（15nM）組和DNMT1siRNA（30nM）組的DNMT1的mRNA相對表達量均低于空白對照組(P＜0.05)，且分別低于陰性siRNA（15nM）組和陰性siRNA（30nM）組(P＜0.05)，DNMT1siRNA(30nM)組更低于DNMT1siRNA(15nM)組。
　　4.WST-8法檢測顯示DNMT1siRNA干擾48h， DNMT1siR

13、NA(15nM)組的結腸癌HT-29細胞存活率低于陰性siRNA(15nM)組(P＜0.05); DNMT1siRNA(30nM)組的存活率低于陰性siRNA(30nM)組(P＜0.05);DNMT1siRNA(30nM)組的存活率低于DNMT1siRNA(15nM)組(P＜0.05)。流式細胞術檢測細胞凋亡率，空白對照組的細胞凋亡率最低(P＜0.05); DNMT1siRNA(15nM)組高于陰性siRNA(15nM)組(P＜0.05

14、);DNMT1siRNA(30nM)組高于陰性siRNA(30nM)組(P＜0.05);DNMT1siRNA(30nM)組高于DNMT1siRNA(15nM)組(P＜0.05)。流式細胞儀分析DNA細胞周期，各組G0/G1期所占比例最高，各實驗組均高于空白對照組，DNMT1siRNA(30nM)組和DNMT1siRNA(15nM)組(P＜0.05)明顯高于各自的陰性對照組(P＜0.05);而各實驗組S期細胞所占比例低于空白對照，DNMT

15、1siRNA(15nM)組的S期細胞所占比例明顯低于陰性siRNA(15nM)組(P＜0.05); DNMT1siRNA(15nM)組和DNMT1siRNA(30nM)組的G2/M期細胞比例明顯低于空白組和各組的陰性對照組(P＜0.05)。RT-PCR檢測Bcl-2、Bax、T-cadherin和CDNK1A mRNA表達量，干擾試驗陰陽性組的Bcl-2 mRNA的相對表達量均高于空白對照組，DNMT1siRNA(30nM)組低于陰性s

16、iRNA(30nM)組;干擾試驗陰陽性組的Bax mRNA的相對表達量均高于空白對照組，其中DNMT1siRNA(15nM)組和DNMT1siRNA(30nM)組高于各自的陰性對照組，且在這兩組內Bax mRNA增加的比例遠大于Bcl-2 mRNA增加的比例;干擾試驗陰陽性組的T-cadherin mRNA的相對表達量均高于空白對照組，DNMT1siRNA(15nM)組和DNMT1siRNA(30nM)組高于各自的陰性對照組，且DNMT

17、1siRNA(30nM)組最高;干擾試驗陰陽性組的CDNK1AmRNA的相對表達量均高于空白對照組，DNMT1siRNA(15nM)組和DNMT1siRNA(30nM)組高于各自的陰性對照組，且以DNMT1siRNA(30nM)組為最高。以上比較均基于有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　結論:
　　1.T-cadherin蛋白的表達在結直腸癌組織中表達相對較低，而DNMT1蛋白的表達則相對較高，且二者都與一些臨床參數(shù)密切相關

18、，這將有利于指導臨床分期和評價腫瘤預后。但DNMT1蛋白有使基因甲基化的生物學功能，T-cadherin蛋白的表達過程是否會受到此影響，二者在不同組織中表達量變化的具體機制是什么，需要我們進一步研究。
　　2.結直腸癌組織中T-cadherin下調機制和啟動子甲基化密切相關。DNMT1mRNA的高表達是導致T-cadherin基因啟動子甲基化的重要原因，也是結直腸癌惡性轉化的機制之一。
　　3.DNMT1siRNA干擾可以從

19、mRNA水平影響DNMT1蛋白表達和DNMT酶活性，且三者改變呈一致性。
　　4.DNMT1siRNA干擾在細胞增殖和凋亡兩方面均起到了抑制結腸癌細胞生長的作用;用RNA干擾抑制DNMT分子的活性，可以引起與腫瘤細胞周期和增殖、凋亡相關的調控基因mRNA的表達，從而抑制腫瘤細胞的增殖，誘導凋亡，并影響細胞周期。
　　我們的研究表明:DNMT1對結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中有重要影響。多種結直腸癌相關基因的甲基化與DNMT1活性密切