三七總皂苷對B16細胞縫隙連接功能的影響及其對B16黑色素瘤轉移的抑制作用.pdf

1、研究目的：觀察三七總皂苷(panax notoginseng saponins, PNS)對B16黑色素瘤轉移的作用。同時進一步探明這種作用與其影響 B16細胞縫隙連接細胞間通訊(gap junction intercellular communication, GJIC)及縫隙連接蛋白32（Connexin32，Cx32）表達的關系和內在機制。
　　實驗方法：1.建立B16黑色素瘤自發(fā)性肺轉移模型 C57BL/6小鼠60只，于小

2、鼠左后肢爪墊皮下注射 B16黑色素瘤細胞懸液50ul（1×107·ml-1）。建立模型24小時后，隨機分成生理鹽水組（NS，0.2 mL·10g-1），PNS（120mg·kg-1）、PNS（240mg·kg-1）、PNS（480mg·kg-1）三個劑量組，每組12只。每日灌胃給藥，給藥體積為0.2 mL·10g-1。（1）接種瘤液后第23天，用0.5％戊巴比妥鈉麻醉小鼠，結扎股動脈，截除荷瘤下肢，稱重，計算抑瘤率。（2）切除原發(fā)灶后繼

3、續(xù)給藥三周，于模型建立后第46天處死小鼠，取下小鼠肺臟，觀察肺臟腫瘤轉移情況，對肺轉移灶進行計數(shù)。（3）免疫組化檢測Cx32在黑色素瘤原發(fā)灶的表達情況，觀察PNS對黑色素瘤原發(fā)灶中Cx32表達的影響。2.采用劃痕標記/染料示蹤技術（SL/DT），觀察不同濃度 PNS作用 B16細胞，其 GJIC功能的變化。用分子量為457.2D的熒光黃染料(Lucifer Yellow, LY)標記損傷細胞，通過LY染料在細胞間的傳遞情況來反映細胞間的

4、縫隙連接通訊功能。3.免疫印跡（Western blot）檢測Cx32在各組B16細胞中的表達情況。4.通過細胞-基質粘附實驗，觀察PNS對B16細胞與基質膠（Matrigel）的粘附能力的影響
　　實驗結果：1.成功建立B16黑色素瘤自發(fā)性肺轉移模型小鼠于接種腫瘤細胞后8~12天在接種部位形成黑素沉著斑，之后逐漸增大，突起，形成腫瘤結節(jié)。于接種瘤液后第23天切除腫瘤，見腫瘤質地較軟，黑色，包膜基本完整部分有壞死或潰瘍。HE染色病

5、理組織學檢查：瘤組織排列結構復雜，呈巢狀、或彌散分布。細胞體積大，多邊形，核呈空泡狀，核仁明顯，部分可見核分裂像，腫瘤細胞內含有黑色素顆粒，提示B16-BL6小鼠黑色素瘤自發(fā)性轉移模型復制成功。2. PNS對原發(fā)位黑色素瘤生長的影響 PNS（240mg·kg-1、480mg·kg-1）兩個劑量組，與對照組瘤重相比較具有顯著性差異，腫瘤抑制率分別達到32.09%和50.85%。3. PNS對黑色素瘤肺轉移的影響通過對小鼠肺轉移灶計數(shù)和評分

6、結果進行統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)，與模型組相比PNS240mg·kg-1、480mg·kg-1兩個劑量組能有效抑制黑色素瘤的肺轉移，轉移灶數(shù)量和大小與對照組相比有明顯地減少和縮小。4. PNS對黑色素瘤細胞膜上Cx32的表達的影響免疫組織化學檢測并對染色結果進行分級，經(jīng)分析后得到的結果顯示：PNS各用藥組中的黑色素瘤原發(fā)灶腫瘤細胞膜上Cx32的表達均得到了增強。5. PNS對B16細胞的縫隙連接通訊功能的作用采用劃痕標記/染料示蹤技術（SL/DT

7、）在熒光顯微鏡下進行觀察，發(fā)現(xiàn)不同劑量的PNS（100μg·ml-1、200μg·ml-1、400μg·ml-1）在不同程度上提高了B16細胞間的GJIC功能。隨PNS濃度增高，LY染料傳輸范圍逐漸增大，最遠可達劃痕旁3～4層細胞。6. PNS對B16細胞中Cx32的表達量的影響 Western blot的檢測結果顯示PNS各劑量組與對照組比較Cx32的表達量無明顯變化。7. PNS對B16細胞與基質的粘附能力的影響通過細胞-基質粘附實

8、驗結果計算腫瘤細胞的相對粘附率，結果顯示PNS能夠抑制 B16細胞的基質粘附能力。同時發(fā)現(xiàn)GJ功能增強劑維甲酸鈉（all trans-retinoic acid,RA）同樣具有抑制 B16細胞與基質粘附能力的作用，表明GJ功能的上調和恢復能夠影響腫瘤細胞的基質粘附能力。PNS對B16細胞的基質粘附能力的抑制作用可能與其上調腫瘤細胞間的GJ功能有關。
　　實驗結論：
　　1. PNS能夠抑制B16黑色素瘤的生長和轉移。