維生素E琥珀酸酯對黑色素瘤B16荷瘤小鼠抑瘤作用及其機制的實驗研究.pdf

1、目的:通過動物實驗,研究維生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate,VES;α-tocopheryl succinate,α-TOS)對黑色素瘤細胞的增殖、分化、凋亡的影響。通過相關蛋白表達的變化,進一步探討VES抑制黑色素瘤細胞生長的作用機制,從而為黑色素瘤治療提供新的方法及相應的理論依據(jù)。
　　 方法:將40只雄性BALB/c小鼠隨機分為5組,每組8只。將鼠黑色素瘤B16細胞懸液接種于各組小鼠右側背部皮下,每只

2、1×106個,建立小鼠黑色素瘤移植瘤模型。當多數(shù)小鼠荷瘤后開始給藥,采用腹腔注射給藥方式:實驗組分別給予VES12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg腹腔注射,每天一次,連續(xù)五天,休兩天,共兩周;對照組給予芝麻油0.05ml/只,給藥方法及時間同實驗組;陽性對照組給予達卡巴嗪(Dacarbazine,DTIC)0.2ml(80mg/kg)腹腔注射,每天一次,連續(xù)五天。兩周后,頸椎脫臼處死各組小鼠,剝瘤稱重,計算抑瘤率;顯微鏡觀

3、察VES作用后的瘤細胞大體形態(tài)變化,透射電鏡觀察VES作用后的瘤細胞超微結構變化;流式細胞術檢測各組瘤細胞周期分布及凋亡率;免疫組化法檢測各組瘤細胞S-100,Survivin,Caspase-3的蛋白表達情況;運用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理,統(tǒng)計分析。
　　 結果:
　　 1 VES可抑制小鼠腫瘤生長:VES(12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg)各劑量組對小鼠B16移植瘤的抑制率分別為:13

4、.72％、31.22％、45.58％,呈劑量依賴性。達卡巴嗪組抑瘤率為55.64％,高于VES各組。各組小鼠處死前的體重比較:VES各處理組與對照組相比,差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05);陽性對照組體重有較明顯下降,與陰性對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。
　　 2 VES可阻滯瘤細胞周期、誘導分化和凋亡:流式細胞分析儀檢測結果顯示VES12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg劑量組的細胞,S期比例逐漸增加

5、,呈劑量相關性,與陰性對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05或p＜0.01)。VES12.5mg/kg、25mg/kg劑量組瘤細胞的G0/G1期細胞比例逐漸增加,與陰性對照組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05或p＜0.01)。VES各劑量組瘤細胞的凋亡率分別為:20.88±0.58％、22.71±0.55％、27.22±0.59％,陰性對照組為6.73±0.97％,均低于陽性對照組凋亡率30.95±0.52％,VES各組與對照組

6、、陽性對照組相比,差異均有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。
　　 3 VES對瘤組織細胞形態(tài)的影響:
　　 3.1經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色后,電子顯微鏡下觀察細胞形態(tài):陰性對照組瘤組織邊界不清,細胞密集排列,異型性明顯,而VES治療組(12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg)瘤組織中心及邊緣可見不同程度的片狀或灶性壞死,黑色素顆粒釋出,散布于細胞間。
　　 3.2透射電鏡觀察:在未經(jīng)VES處理過的陰性對

7、照組移植瘤B16細胞中,胞膜完整,細胞核大,不規(guī)則形,核質比大,常染色質豐富,異染色質較少,胞質中細胞器少,未見典型的黑色素小體;然而,經(jīng)VES(12.5mg/kg、25mg/kg)作用后,細胞表面微絨毛減少,細胞核變小,核內異染色質增多,部分濃縮,核質比變小,可見大量典型的黑色素小體;50mg/kgVES作用后,細胞出現(xiàn)不同程度凋亡改變;胞質中出現(xiàn)空泡,線粒體脊和膜部分或大部分融合消失,核膜局部向外呈泡狀突起,核染色質高度濃縮,電子密

8、度增高,邊集于核膜下,形成新月體狀,即凋亡細胞的特征性形態(tài)改變,凋亡半月,但無凋亡小體。
　　 4免疫組化檢測瘤細胞S-100、Survivin、Caspase-3蛋白表達:按照IHS值法進行免疫組化評分。VES各組Survivin、S-100蛋白表達值(IHS值)隨VES濃度增大而降低,Ca spase-3蛋白表達值隨VES濃度增大而升高。三種蛋白各自比較,VES處理組和陰性對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(p＜0.05或p＜0.0

9、1)。且各治療組Survivin的表達與Caspase-3、的表達呈負相關性(rs=-0.705,p＜0.01);與S-100的表達呈正相關(rs=0.797,p＜0.01)。
　　 結論:
　　 1 VES對鼠B16黑色素瘤移植瘤生長有顯著的抑制作用,且呈一定的量效關系。
　　 2 VES有雙重作用,12.5mg/kg、25mg/kg VES可將細胞阻滯于G0/G1期,誘導部分惡性黑色素瘤細胞分化,透射電鏡觀察

10、可見大量典型的黑色素小體。50mg/kgVES可以阻滯B16細胞周期于S期,誘導凋亡,抑制腫瘤增殖。
　　 3 VES具有抑制黑色素瘤增殖,致S-100表達減低,降低其惡性程度的作用。其機制可能是一方面下調Survivin蛋白,調節(jié)瘤細胞分化;另一方面啟動Caspase-3依賴的凋亡途徑。
　　 4 VES對鼠B16黑色素瘤移植瘤生長有較顯著的抑制作用,低劑量誘導分化,高劑量誘導凋亡,為臨床惡性黑色素瘤的治療和化學藥物預