Ghrelin在肥胖發(fā)生機(jī)制中的實(shí)驗(yàn)研究 及臨床意義探討.pdf

1、基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)部分：
　　 本研究以3T3-L1前脂肪細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察ghrelin對(duì)其增殖、分化和凋亡的影響，并探討其可能的分子生物學(xué)機(jī)制，進(jìn)而深化對(duì)ghrelin這一目前已知的唯一能夠促進(jìn)食欲的外周激素的認(rèn)識(shí)，深化對(duì)脂肪細(xì)胞增殖、分化和凋亡分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，并進(jìn)一步為肥胖及其相關(guān)疾病的預(yù)防和治療提供新的研究方向。
　　 第一部分：生長(zhǎng)激素促分泌素受體-1a基因在脂肪細(xì)胞分化成熟中的作用研究
　　 目的：通過(guò)觀察生

2、長(zhǎng)激素促分泌素受體-1a基因在3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中不同時(shí)段表達(dá)水平的變化，從而進(jìn)一步探討GHSR-1a基因在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的作用。
　　 方法：體外培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞，采用經(jīng)典的激素雞尾酒誘導(dǎo)分化法誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化。在誘導(dǎo)其向成熟脂肪細(xì)胞分化的不同時(shí)段，采用光學(xué)顯微鏡觀察脂肪細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化及細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成，通過(guò)油紅O染色測(cè)定脂肪細(xì)胞分化程度及細(xì)胞內(nèi)脂滴的聚積情況，采用化學(xué)比色法測(cè)定脂

3、肪細(xì)胞中甘油三酯的總量，采用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)脂肪細(xì)胞中GHSR-1a基因mRNA表達(dá)水平的變化。
　　 結(jié)果：誘導(dǎo)分化前，3T3-L1 前脂肪細(xì)胞呈梭形的成纖維細(xì)胞形態(tài)，胞漿內(nèi)無(wú)脂滴；誘導(dǎo)分化第4天時(shí)，脂肪細(xì)胞變大、變圓，胞漿中出現(xiàn)脂滴；分化第6天時(shí)，細(xì)胞進(jìn)一步變大、變圓，脂滴明顯增多，分布于核周圍，形成“戒環(huán)”樣結(jié)構(gòu)，從形態(tài)上由前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)變；分化第8天時(shí)，胞漿中更多的脂滴積聚，大多數(shù)細(xì)胞分化成

4、熟。分化第4天時(shí)，脂肪細(xì)胞的TG總量明顯升高，分化第8天時(shí)TG總量進(jìn)一步升高，與前脂肪細(xì)胞和對(duì)照組相比差異均有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，GHSR-1a基因mRNA低表達(dá)于3T3-L1前脂肪細(xì)胞和分化第1天的脂肪細(xì)胞，隨著脂肪細(xì)胞逐漸分化成熟，分化第4天和第8天時(shí)GHSR-1a基因mRNA的表達(dá)逐漸增加，分別是前脂肪細(xì)胞的1.7倍和1.9倍，差異均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；分化第8天時(shí)GHSR-1a基因mRNA的表達(dá)分別是分化第1天和第4天的1

5、.3倍和1.1倍，差異均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；GHSR-1a基因mRNA的表達(dá)水平除在誘導(dǎo)分化第0～1天和第1～4天內(nèi)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余各時(shí)間段間表達(dá)水平差異均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：經(jīng)典的激素雞尾酒誘導(dǎo)分化法能夠誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化，并且能夠顯著增加前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中甘油三酯的積累。3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中GHSR-1a基因表達(dá)逐漸上調(diào)，其表達(dá)變化與脂肪細(xì)胞分化、脂質(zhì)積聚過(guò)程相一

6、致，可能參與了脂肪細(xì)胞分化過(guò)程。
　　 第二部分：Ghrelin對(duì)前脂肪細(xì)胞增殖的作用及相關(guān)機(jī)制的研究
　　 目的：觀察不同濃度ghrelin對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖活力的影響，進(jìn)而探討其可能的作用機(jī)制。
　　 方法：體外培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞，采用MTT法檢測(cè)不同濃度ghrelin對(duì)其增殖活力的影響，采用半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)ghrelin對(duì)前脂肪細(xì)胞c-myc和胸苷激酶基因mRNA表達(dá)水平的影響。

7、
　　 結(jié)果：10-7～10-15mol/L ghrelin作用24h均能明顯促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖，其中10-11mol/L時(shí)促增殖效應(yīng)最明顯，而且同一濃度ghrelin促進(jìn)前脂肪細(xì)胞增殖的效應(yīng)隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而提高；ghrelin干預(yù)后前脂肪細(xì)胞c-myc和胸苷激酶基因mRNA表達(dá)水平明顯升高，與對(duì)照組相比差異均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：Ghrelin能夠促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖。Ghrelin

8、可能通過(guò)增加c-myc的含量，進(jìn)而引起胸苷激酶的活化，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期的激活，促進(jìn)細(xì)胞增殖。
　　 第三部分：Ghrelin誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中形態(tài)學(xué)觀察、甘油三酯總量變化及分化轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的研究
　　 目的：通過(guò)觀察ghrelin誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的形態(tài)學(xué)變化，測(cè)定分化過(guò)程中甘油三酯在細(xì)胞中的累積情況，檢測(cè)分化過(guò)程中分化轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況，進(jìn)而探討ghrelin誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化的作用機(jī)制。

9、　　 方法：體外培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞，采用經(jīng)典的激素雞尾酒誘導(dǎo)分化法以及ghrelin誘導(dǎo)其分化。在誘導(dǎo)其向成熟脂肪細(xì)胞分化的不同時(shí)段，采用光學(xué)顯微鏡觀察脂肪細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化及細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成，通過(guò)油紅O染色測(cè)定脂肪細(xì)胞分化程度及脂滴的聚積情況，采用化學(xué)比色法測(cè)定脂肪細(xì)胞TG總量，采用半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)脂肪細(xì)胞中過(guò)氧化物酶體增殖劑活化受體γ、CAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α基因mRNA的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：3T3-

10、L1前脂肪細(xì)胞呈典型的梭形，胞漿中無(wú)脂滴，形態(tài)與成纖維細(xì)胞相似。Ghrelin誘導(dǎo)分化第4天時(shí)，細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始變圓，僅少量細(xì)胞中出現(xiàn)細(xì)小的脂滴；分化第6天時(shí)，細(xì)胞變圓，體積稍變大，胞漿中脂滴增多，聚集在細(xì)胞核周圍；分化第8天時(shí)，細(xì)胞明顯變大、變圓，胞漿內(nèi)出現(xiàn)明顯的脂滴，脂滴分布于核周圍，形成“戒環(huán)”樣結(jié)構(gòu)。10-11mol/L ghrelin誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化率可達(dá)70%，而激素雞尾酒誘導(dǎo)分化組為90%。誘導(dǎo)分化第4天時(shí)，g

11、hrelin組脂肪細(xì)胞的TG總量明顯升高，與前脂肪細(xì)胞和對(duì)照組相比差異均有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；分化第8天時(shí)，TG總量進(jìn)一步升高，與前脂肪細(xì)胞、分化第4天時(shí)的脂肪細(xì)胞和對(duì)照組相比差異均有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ghrelin誘導(dǎo)分化第4天時(shí)，PPARγ基因mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組升高，是對(duì)照組的1.77倍，差異有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；分化第8天時(shí)，PPARγ基因mRNA表達(dá)進(jìn)一步升高，分別是對(duì)照組和分化第4天時(shí)的1.62倍和1.81倍，差異均有

12、極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而ghrelin組與同分化時(shí)間點(diǎn)Insulin組比較，差異沒(méi)有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ghrelin誘導(dǎo)分化第4天時(shí)，C/EBPα基因mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組升高，是對(duì)照組的1.44倍，差異有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；分化第8天時(shí)，C/EBPα基因mRNA表達(dá)進(jìn)一步升高，分別是對(duì)照組和分化第4天時(shí)的1.44倍和2.08倍，差異均有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而ghrelin組與同分化時(shí)間點(diǎn)Insulin組比較，分化第4天時(shí)差異沒(méi)有顯著的

13、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分化第8天時(shí)差異有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：Ghrelin具有誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的生物學(xué)作用，PPARγ、C/EBPα隨著脂肪細(xì)胞分化的進(jìn)行表達(dá)水平逐漸升高，并發(fā)揮協(xié)同作用，直至終末分化期。這提示在ghrelin誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，PPARγ、C/EBPα對(duì)細(xì)胞完成終末分化具有重要意義。
　　 第四部分：Ghrelin對(duì)前脂肪細(xì)胞凋亡的作用及相關(guān)機(jī)制的研究
　　 目的：通過(guò)觀

14、察不同濃度ghrelin對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的影響，以及p-ERK1/2和p-Akt蛋白表達(dá)水平的變化，進(jìn)而探討ghrelin對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞凋亡的作用及分子機(jī)制。
　　 方法：體外培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞，采用Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀分析不同濃度ghrelin對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞凋亡率的影響；采用PI單染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的構(gòu)成；采用Western blot方法檢測(cè)

15、ghrelin干預(yù)后脂肪細(xì)胞p-ERK1/2和p-Akt蛋白表達(dá)水平的變化。
　　 結(jié)果：10-7～10-15mol/L ghrelin組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組細(xì)胞凋亡率顯著降低，流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期分析顯示10-11mol/L ghrelin干預(yù)后，3T3-L1前脂肪細(xì)胞處于亞二倍體峰的細(xì)胞數(shù)明顯減少，而G0/G1，S和G2/M期細(xì)胞數(shù)基本不變。10-7～10-15mol/L ghrelin均可以引起前脂肪細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞ERK1

16、/2快速而強(qiáng)烈的活化，然而ghrelin誘導(dǎo)的ERK1/2的活化在脂肪細(xì)胞分化早期雖然與對(duì)照組相比明顯升高，但是與分化前和成熟脂肪細(xì)胞相比卻是明顯減弱的；同時(shí)在前脂肪細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞中，ghrelin誘導(dǎo)的ERK1/2的活化可早至ghrelin刺激后2min，在5～10min達(dá)到作用高峰，持續(xù)至少30min以上，然而在脂肪細(xì)胞分化早期，ERK1/2的活化持續(xù)僅不足10min。10-9～10-15mol/L ghrelin均可以引起前脂

17、肪細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞Akt的活化，同時(shí)在前脂肪細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞中，ghrelin刺激30min后即可檢測(cè)到p-Akt蛋白的高水平表達(dá)，并且持續(xù)高水平表達(dá)可達(dá)24h。
　　 結(jié)論：Ghrelin可以抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞凋亡，而ERK1/2和PI3K/Akt信號(hào)通路可能參與了ghrelin調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的過(guò)程。
　　 臨床實(shí)驗(yàn)部分：
　　 目的：檢測(cè)單純性肥胖癥兒童血漿ghrelin的水平，并進(jìn)一步探討ghre

18、lin與兒童肥胖相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系及其臨床意義。
　　 方法：采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)肥胖組32例兒童和正常對(duì)照組35例兒童血漿ghrelin水平，同時(shí)檢測(cè)各組兒童血胰島素、甘油三酯、膽固醇水平，并分析ghrelin與胰島素、甘油三酯、膽固醇的相關(guān)性。
　　 結(jié)論：?jiǎn)渭冃苑逝职Y兒童血漿ghrelin水平降低，且與胰島素、甘油三酯呈顯著負(fù)相關(guān)，這提示ghrelin是一個(gè)反映機(jī)體營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的標(biāo)志，并且以負(fù)反饋的模式參與對(duì)能量代