食管鱗癌中AJUBA突變的分子機制及臨床意義.pdf

1、目的:食管癌是世界第八大腫瘤，占據(jù)腫瘤導(dǎo)致死亡的第六位，其中絕大部分食管癌的病理類型為鱗癌，但是食管鱗癌的五年生存率只有不足15％，近年來總生存期也沒有明顯的延長，這跟目前缺少有效的治療有關(guān)。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，在多個食管鱗癌隊列當(dāng)中發(fā)現(xiàn)AJUBA基因突變，而相關(guān)研究是匱乏的，探索AJUBA突變在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的分子機制及臨床意義，可能改善患者的預(yù)后，提供新的治療靶點。
　　方法:本論文收集了五個食管鱗癌的隊列，共545

2、例患者，都有臨床信息及全外顯子組測序數(shù)據(jù)，通過統(tǒng)計學(xué)分析AJUBA突變與患者TNM分期的相關(guān)性，分別繪制AJUBA突變型與野生型患者的Kaplan-Meier曲線，通過Log-Rank比較兩者是否有顯著差異，以獲得可能的AJUBA突變的臨床意義，指導(dǎo)進一步的機制探索及臨床應(yīng)用。同時，運用293T細(xì)胞包裝慢病毒，慢病毒感染目的細(xì)胞構(gòu)建可供研究AJUBA突變的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，這包括穩(wěn)定敲降的細(xì)胞系，過表達野生型AJUBA的細(xì)胞系及過表達突變型的

3、細(xì)胞系，通過流式熒光分選、潮霉素/嘌呤霉素進行篩選，RT-PCR及蛋白印跡進行驗證。在構(gòu)建細(xì)胞系基礎(chǔ)上，進行CCK-8、Transwell細(xì)胞功能實驗，體外驗證AJUBA突變與細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的關(guān)系。
　　結(jié)果:在545例患者當(dāng)中，AJUBA突變型及野生型的TNM分期沒有顯著差異（Fisher確切概率p=1.000），AJUBA突變型患者Kaplan-Meier曲線有生存時間更長的趨勢（Log-Rank檢驗p=0.13）。構(gòu)建

4、穩(wěn)轉(zhuǎn)敲降細(xì)胞株，感染后10日通過潮霉素/流式熒光分選進行篩選，RT-PCR及蛋白印跡驗證有一定的敲降效率，但是敲降效率不高。構(gòu)建過表達野生型及突變型細(xì)胞株，通過嘌呤霉素進行篩選，運用蛋白印跡技術(shù)驗證，可見野生型AJUBA條帶及截短的突變型AJUBA條帶，構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)過表達細(xì)胞系成功。通過CCK-8比較過表達細(xì)胞系與野生型細(xì)胞系的增殖能力，發(fā)現(xiàn)三個過表達細(xì)胞系的增殖能力都強于野生型細(xì)胞系(t檢驗48h:p＜0.001，p＜0.001，p＜0.

5、001;72h: p=0.008，p＜0.001，p＜0.001)。Transwell實驗比較過表達細(xì)胞系與野生型細(xì)胞系的遷移及侵襲能力，三個過表達細(xì)胞系的遷移能力強于野生型細(xì)胞系（t檢驗:p＜0.001，p＜0.001，p＜0.001），過表達野生型AJUBA及突變1的侵襲能力強于野生型細(xì)胞系（t檢驗:p＜0.001，p=0.035，p=0.576），其中過表達野生型AJUBA細(xì)胞系的遷移及侵襲能力增強最為顯著。
　　結(jié)論:AJ

6、UBA突變型的食管鱗癌患者預(yù)后相對于AJUBA野生型的患者有更好的趨勢。構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)敲降細(xì)胞系可作為進一步研究的對照，并為構(gòu)建敲降后過表達突變型AJUBA的細(xì)胞系打下基礎(chǔ)。過表達突變型細(xì)胞系可供研究AJUBA突變，作為進一步體外體內(nèi)實驗的基礎(chǔ)。過表達野生型及突變型AJUBA的KYSE450細(xì)胞系具有更強的增殖能力。過表達野生型及突變型AJUBA的KYSE450細(xì)胞系具有更強的遷移和侵襲能力（除了突變2的侵襲能力），其中以過表達野生型AJUB