混合型肝細胞—膽管細胞癌發(fā)生機制及臨床意義的研究.pdf

1、[背景及目的]
　　 在多種慢性肝臟疾病情況下，肝細胞死亡，同時成熟肝細胞增殖能力也受到抑制或者衰竭。隱藏于赫令管的干/祖細胞組分激活。這些細胞增殖能力增強，擴增形成膽管反應(yīng)。膽管反應(yīng)已經(jīng)被證明與炎癥壞死程度和纖維化程度密切相關(guān)。因為大部分慢性肝臟疾病都是原發(fā)性肝癌的強烈致病因素，目前普遍認為肝祖細胞成分的激活與肝癌發(fā)生關(guān)系密切：肝祖細胞在慢性肝炎情況下是潛在的癌變靶點；另外，一部分肝臟腫瘤被認為起源于肝祖細胞。肝癌的祖細胞樣表

2、型提示該腫瘤的祖細胞起源，并且這一表型常常與較差的預(yù)后存在相關(guān)性。
　　 混合型肝細胞.膽管細胞癌(CHC)是一種同時包含肝細胞癌(HCC)和膽管細胞癌(ICC)成分的原發(fā)性肝臟腫瘤。1949年Allen和Lisa提出了CHC的病理分型方法，分別為雙結(jié)節(jié)腫瘤，雙結(jié)節(jié)融合型腫瘤或混合型。世界衛(wèi)生組織(WHO)的診斷標準根據(jù)起源的不同，將雙結(jié)節(jié)腫瘤排除在混合型肝細胞-膽管細胞癌診斷之外。
　　 雖然相對罕見，混合型肝癌仍然由

3、于其獨特的臨床病理學(xué)特征而吸引了廣泛的關(guān)注。其主要表現(xiàn)為潛在的祖細胞起源，較強的侵襲性和較差的預(yù)后。目前，祖細胞相關(guān)的腫瘤表型已經(jīng)在形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)表型的觀察中被證實。另外，一些臨床特征與生存的相關(guān)性也曾被闡述。但是，其病理學(xué)特征與臨床預(yù)后的關(guān)系目前還沒有被闡明。而且，混合型肝細胞.膽管細胞癌具備顯著的細胞學(xué)異質(zhì)性，為研究祖細胞與肝癌的發(fā)生提供了良好的模型。
　　 因此，我們首先對80例肝切除術(shù)混合型肝細胞-膽管細胞癌病例展開了以

4、祖細胞相關(guān)特征為重點的臨床病理研究，旨在發(fā)現(xiàn)這些臨床病理特征與臨床治療轉(zhuǎn)歸之間的聯(lián)系。該研究基于常規(guī)的免疫組織化學(xué)技術(shù)，采用精確到特定組織學(xué)結(jié)構(gòu)的先進量化方法。我們應(yīng)用高級的統(tǒng)計學(xué)方法將量化的組織學(xué)指標和其他臨床病理學(xué)資料以及臨床轉(zhuǎn)歸進行關(guān)聯(lián)，以期探索這些指標對臨床預(yù)后的預(yù)測意義以及探討影響預(yù)后的可能機制。隨后，我們建立了一個原位混合型肝細胞-膽管細胞癌小鼠模型。并利用比較病理學(xué)的方法與人類混合型肝細胞-膽管細胞癌進行了對比，從組織學(xué)上

5、驗證了該模型的適用性，為進一步的機制研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 [方法]
　　 1.收集臨床資料和隨訪：我們收集整理了1997年到2003年間80例術(shù)后病理確診為混合型肝細胞-膽管細胞癌病人的臨床資料。80例自手術(shù)后接受隨訪觀察患者復(fù)發(fā)和生存的情況，隨訪工作截止于2008年7月。
　　 2.組織學(xué)診斷和分析：混合型肝細胞膽管細胞癌的組織學(xué)診斷主要依據(jù)WHO診斷標準。HepParl、K18、K7和K19染色作為輔助診斷

6、指標。肝細胞癌區(qū)域“多中心發(fā)生”特征的群體定義為：(1)至少存在兩個腫瘤結(jié)節(jié)，其中一個表現(xiàn)為高分化腫瘤位于不典型增生結(jié)節(jié)中，呈現(xiàn)“節(jié)中節(jié)”表現(xiàn)；(2)中等或低分化腫瘤結(jié)節(jié)存在高分化的邊緣部分。癌旁組織的肝炎肝纖維化水平采用Ishak提出的系統(tǒng)進行評估。
　　 3.免疫組織化學(xué)及量化評估：免疫組化染色的評估主要依靠計算機輔助的染色強度分析或主觀評價。我們用癌旁組織切片中K7染色的情況來評估匯管區(qū)的實質(zhì).間質(zhì)交界處的膽管反應(yīng)，基于其

7、涵蓋肝實質(zhì)-間質(zhì)界面的比例。K7陽性的中間型肝細胞-膽管細胞按照Roskams提出的方法進行半定量評估。OV-6陽性肝細胞的評估采用計算機輔助計算肝細胞OV-6的表達強度。另外，PCNA被用來評價RDCs的增值狀態(tài)。膽管反應(yīng)的增殖指數(shù)(PI-DR)指PCNA陽性細胞數(shù)與RDCs總數(shù)的比值。
　　 4.統(tǒng)計學(xué)分析：所有連續(xù)變量在接受進一步統(tǒng)計學(xué)分析之前都接受正態(tài)性檢驗。用方差分析(多組)或student'st檢驗(兩組)進行均數(shù)的

8、比較分析，多組間的多重比較用Dunnett’s檢驗。對于非正態(tài)分布數(shù)據(jù)的比較使用Mann-WhitneyU檢驗。兩組變量的相關(guān)性根據(jù)其數(shù)據(jù)分布類型的不同采用Spearman或Pearson相關(guān)性檢驗。生存分析采用Kaplan-Mayer法，Log-Rank檢驗提供統(tǒng)計學(xué)差異。多因素分析方面，因變量為正態(tài)分布連續(xù)變量時，采用多元線性回歸的方法；因變量為兩分類變量時，使用Logistic風(fēng)險回歸；當(dāng)因變量為生存指標時，采用Cox比例風(fēng)險回歸

9、。多元回歸采用逐步回歸法，采用回退法篩除無統(tǒng)計學(xué)意義變量，最大似然法估計參數(shù)。
　　 5.建立小鼠模型：我們選取P53-/-C57BL/6J小鼠胚肝中的祖細胞作為可能的腫瘤前體細胞，分選培養(yǎng)后移植到野生型的C57BL/6J小鼠肝臟。
　　 [結(jié)果]
　　 1.臨床、組織學(xué)以及隨訪數(shù)據(jù)：80例病例中，85％的病人合并HBV感染，55％的病人基礎(chǔ)疾病為HBV感染相關(guān)的肝硬化。70例接受根治切除的病人的總體1、3和5年

10、生存率為74.3％，38.6％和30％，無瘤生存率為41.1％、18.6和10.0％。64例(91.4％)的病人發(fā)生了術(shù)后復(fù)發(fā)。
　　 2.癌旁膽管反應(yīng)的觀察：80例病例的癌旁組織均可見不同程度增強的膽管反應(yīng)(K7-DR)。PI-DR在26.3％的病例中表現(xiàn)出≥50％，提示處于高度的增殖狀態(tài)。
　　 3.癌旁膽管反應(yīng)與轉(zhuǎn)化增殖肝祖細胞關(guān)系密切：高PI-DR，而不是高K7-DR的病例，具備更多的中間型肝細胞-膽管細胞以及更

11、高的肝細胞OV-6表達水平。PI-DR還與祖細胞的數(shù)量以及DR中Bmi-1的表達成正相關(guān)。進一步分析PI-DR與其他臨床病理資料的相關(guān)性，我們發(fā)現(xiàn)PI-DR與患者手術(shù)時的年齡，肝纖維化水平以及肝細胞的增殖抑制程度呈獨立相關(guān)性。
　　 4.PI-DR與術(shù)后無瘤生存率具有相關(guān)性：在患者總體生存(overallsurvival，OS)的分析中，多因素分析發(fā)現(xiàn)：PI-DR、K7-DR、MO、AFP在腫瘤中的表達均為總體生存的獨立預(yù)后因素

12、。而在無瘤生存分析中，發(fā)現(xiàn)MVI和PI-DR是患者無瘤生存的獨立影響因素。
　　 5.祖細胞介導(dǎo)的癌旁肝再生模式具有較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險：OV-6和AFP在中間型肝細胞的共定位表達罕見。肝實質(zhì)細胞OV-6和AFP表達呈負相關(guān)。以O(shè)V-6表達和AFP表達區(qū)分的肝臟再生狀態(tài)與術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)。
　　 6.PI-DR與混合型肝細胞-膽管細胞癌腫瘤內(nèi)多種祖細胞標志物的表達存在聯(lián)系。
　　 7.混合型肝細胞-膽管細胞癌“多中心發(fā)生”

13、特征與癌旁祖細胞激活關(guān)系密切
　　 8.祖細胞起始的小鼠混合型肝細胞-膽管細胞癌模型與人類肝細胞-膽管細胞癌病理學(xué)上高度相似：(1)具備明確的肝細胞和膽管細胞成分；(2)與人類腫瘤相似組織學(xué)表現(xiàn)的中間型區(qū)域；(3)腫瘤細胞同時表達肝細胞和膽管細胞標志物；(4)呈浸潤性、多灶性生長；(5)腫瘤細胞具備高侵襲性。
　　 [討論]
　　 所有的結(jié)果提示：
　　 1.混合型肝細胞-膽管細胞癌具備顯著的腫瘤異質(zhì)性，

14、可能與其肝祖細胞起源有關(guān)。
　　 2.在復(fù)雜的肝臟疾病演進過程中，與肝臟的修復(fù)方式密切相關(guān)的多樣化的膽管反應(yīng)可共存于同一基礎(chǔ)肝臟疾病情況下。膽管反應(yīng)的增殖狀態(tài)可以部分反映肝祖細胞轉(zhuǎn)化增殖的活性。
　　 3.膽管反應(yīng)的增殖狀態(tài)可以預(yù)測混合型肝細胞-膽管細胞癌的術(shù)后復(fù)發(fā)。以肝實質(zhì)修復(fù)為目的的祖細胞激活可能是混合型肝細胞-膽管細胞癌的重要驅(qū)動力。
　　 4.膽管反應(yīng)的增殖狀態(tài)與腫瘤內(nèi)異質(zhì)性(腫瘤分化和表型)存在密切聯(lián)系