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文檔簡介
1、研究背景與目的: 促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin-releasinghormone,CRH)是下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)軸上游重要的神經(jīng)激素和調(diào)節(jié)因子之一,通過調(diào)節(jié)垂體釋放促腎上腺皮質(zhì)激素(arenocorticotrophichormone,ACTH)來控制糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid,GC)在腎上腺皮質(zhì)的分泌。Urocorti
2、n(UCN)則是近年發(fā)現(xiàn)的CRH結(jié)構(gòu)相關(guān)肽之一,它可與CRH受體家族的兩個主要成員CRH-R1和CRH-R2結(jié)合來發(fā)揮生物學效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),CRH和UCN與免疫系統(tǒng)關(guān)系密切,不僅可通過調(diào)控HPA軸上GC的釋放來調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng);還可通過免疫細胞表面的CRH受體,發(fā)揮直接的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。哺乳動物在正常生理及應(yīng)激條件下外周血CRH和UCN濃度均較低,但是在炎癥局部則存在較高水平的CRH和UCN。研究證實部分免疫細胞可表達CRH和UCN,其表
3、達水平在細胞免疫激活后會顯著上調(diào)。因此,目前普遍認為參與直接調(diào)節(jié)免疫細胞功能的外周CRH和UCN主要來源于炎癥反應(yīng)局部,通過自分泌和旁分泌方式發(fā)揮作用。巨噬細胞是炎癥反應(yīng)啟動細胞之一,參與了細胞和體液免疫過程,是重要的殺微生物效應(yīng)細胞,在感染等疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。內(nèi)毒素(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分,是革蘭氏陰性菌感染時誘發(fā)炎癥反應(yīng)的主要物質(zhì)之一;它可誘導(dǎo)巨噬細胞釋放TN
4、F-α等炎癥介質(zhì),外源性CRH和UCN及其受體拮抗劑可顯著影響LPS的該作用效應(yīng),并改變了內(nèi)毒素血癥小鼠的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸;LPS也可引起巨噬細胞表面的TLR4上調(diào),而外源性CRH及UCN增強了LPS的該作用效應(yīng)。因此,CRH及UCN在LPS介導(dǎo)的巨噬細胞功能改變中發(fā)揮了重要作用;但是LPS作用于巨噬細胞后,內(nèi)源性CRH和UCN在巨噬細胞的表達及其調(diào)控機制目前仍不清楚。 因此,本課題旨在探討內(nèi)毒素作用后巨噬細胞表達CRH和UCN的規(guī)律
5、及其可能的表達調(diào)控通路。 材料與方法: 本課題在體外分離培養(yǎng)健康、成年(230~270g)Wistar大鼠腹腔巨噬細胞的基礎(chǔ)上,利用RT-PCR及ELISA技術(shù)進行以下幾個方面的研究:(1)檢測正常培養(yǎng)的大鼠腹腔巨噬細胞中CRH和UCNmRNA及多肽含量,了解CRH及UCN在正常巨噬細胞的表達水平;(2)用5ng/ml或25ng/ml佛波脂(TPA)處理培養(yǎng)的大鼠腹腔巨噬細胞,檢測處理后1h、2h、4h、8h細胞中CRH
6、及UCNmRNA及多肽含量變化,觀察CRH及UCN在活化腹腔巨噬細胞的表達規(guī)律;(3)用10ng/ml或100ng/mlLPS處理培養(yǎng)的大鼠腹腔巨噬細胞,體外模擬內(nèi)毒素血癥條件,檢測處理1h、2h、4h、8h時細胞中CRH及UCNmRNA及多肽含量變化,揭示內(nèi)毒素作用下巨噬細胞表達CRH及UCN的變化規(guī)律;(4)在加入LPS前30min分別用不同濃度的特異性阻斷劑預(yù)處理細胞阻斷MAPK(mitogen-activatedproteink
7、inase,絲裂原活化蛋白激酶)信號通路中的關(guān)鍵激酶:10μmol/L、50μmol/L、100μmol/LPD98059阻斷細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularsignalregulatedkinase1/2,ERK1/2),10μmol/L、50μmol/LSB203580阻斷c-JunN端蛋白激酶(c-JunN-terminalkinase,JNK),10μmol/L、50μmol/LSP600125阻斷p38MAP
8、K;再用100ng/mlLPS處理細胞。在LPS刺激細胞4h時,檢測細胞中CRHmRNA及多肽含量變化,探討MAPK信號通路在LPS調(diào)控巨噬細胞表達CRH中的作用。 主要結(jié)果: 1.在正常體外培養(yǎng)的大鼠腹腔巨噬細胞中,轉(zhuǎn)錄一定水平的CRH及UCNmRNA(n=8);并合成一定水平的CRH及UCN多肽,胞溶部分CRH多肽約為0.07±0.01ng/107cells(n=6),UCN多肽約為1.0±0.50ng/107cel
9、ls(n=6)。 2.TPA呈時間依賴性上調(diào)大鼠腹腔巨噬細胞中CRH及UCN的表達。CRHmRNA水平在TPA處理細胞8h時達峰值(p<0.01,n=8),約為對照組的2.1倍,不同劑量組間無顯著差異;胞溶部分CRH多肽含量在25ng/mlTPA處理細胞8h時達峰值(p<0.01,n=6),約為對照組的2.0倍,為0.14+0.03ng/107cells。UCNmRNA水平在TPA處理細胞4h時達峰值(p<0.01,n=8),約
10、為對照組的2.1~2.3倍,不同劑量組間無顯著差異;胞溶部分UCN多肽含量在25ng/mlTPA處理細胞8h時達峰值(p<0.01,n=6),約為對照組的7.1.倍,為7.01±0.74ng/107cells。 3.LPS呈時間依賴性上調(diào)大鼠腹腔巨噬細胞中CHR及UCN的表達。CRHmRNA在LPS處理4h時達峰值(p<0.01,n=8),約為對照組的1.9~2.1倍,不同劑量組間無顯著差異;胞溶部分CRH多肽含量在濃度為100
11、ng/ml的LPS處理2h時達峰值(p<0.01,n=6),約為0.30±0.07ng/107cells,在8h時CRH多肽含量仍保持在0.15±0.07ng/107cells,約為對照組的2.1倍。UCNmRNA在LPS處理4h時達峰值(p<0.01,n=8),約為對照組的1.8~2.0倍,不同劑量組間無顯著差異;胞溶部分UCN多肽在100ng/mlLPS處理8h時達峰值(p<0.01,n=6),約為8.68±1.25ng/107ce
12、lls。 4.ERK1/2特異性阻斷劑:PD98059呈劑量依賴性抑制LPS誘導(dǎo)的CRH表達上調(diào),其最大抑制效應(yīng)濃度為100μmol/L,抑制效率在mRNA水平達95%(n=8),在多肽水平達90%(n=6);c-JNK特異性阻斷劑SB203580、p38MAPK特異性阻斷劑SP600125也呈劑量依賴性抑制LPS誘導(dǎo)的CRH表達上調(diào),其濃度為50μmol時抑制效應(yīng)在mRNA水平分別達41%、49%。 結(jié)論: 1
13、.正常腹腔巨噬細胞有CRH及UCN表達,提示它們在維持正常巨噬細胞及其它免疫細胞功能中的潛在意義。 2.佛波脂促進了CRH及UCN在巨噬細胞的表達;在內(nèi)毒素作用的巨噬細胞,CRH及UCN迅速上調(diào)并維持在較高水平,提示激活的巨噬細胞可能轉(zhuǎn)錄合成大量CRH和UCN,參與炎癥局部的病理生理調(diào)節(jié)活動。 3.LPS上調(diào)CRH在腹腔巨噬細胞的表達主要依賴于MAPK信號通路,其中ERK1/2信號通路最為重要。 4.在正常及LP
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