NogO-B在LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答中的作用及其機(jī)制初探.pdf

1、目的:
　　急性肺損傷（Acute lung injury，ALI）是呼吸系統(tǒng)常見(jiàn)的危重癥之一，微生物感染、外傷、毒氣、污染物、自身抗體、胃酸、栓塞和自由脂肪酸等多種生物、物理和化學(xué)因素均可導(dǎo)致ALI。盡管在過(guò)去幾十年中人們對(duì)ALI的認(rèn)識(shí)不斷加深，在治療上也取得了重大進(jìn)步，但ALI的死亡率（約27％到45％不等）仍居高不下，且ALI的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制也尚無(wú)定論。鑒于當(dāng)前臨床上ALI患者面臨著高死亡率、低治愈率和差的生活質(zhì)量的現(xiàn)實(shí)，探

2、明ALI的病理生理機(jī)制從而找到有效的治療措施迫在眉睫。肺泡巨噬細(xì)胞（Alveolar Macrophages，AM）作為肺部主要的固有免疫細(xì)胞，在ALI的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。眾所周知，巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要成分之一，參與了各種炎癥的固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，此外，在損傷修復(fù)、組織重構(gòu)及纖維化等過(guò)程中也起著重要作用。Nogo-B是網(wǎng)狀蛋白家族（reticulon super-family proteins，RTNs）中的成員，

3、因參與了多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程，近來(lái)成為了國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)Nogo-B可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的募集，調(diào)控巨噬細(xì)胞遷移、粘附、吞噬、炎癥因子分泌及殺傷作用等生物學(xué)功能，同時(shí)內(nèi)源性的Nogo-B還可能與巨噬細(xì)胞的活化和轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。然而，在ALI狀態(tài)下，Nogo-B是如何調(diào)控巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答目前尚不明確。我們?cè)谇捌诘难芯恐杏^察到ALI小鼠的肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)細(xì)胞中，肺氣道、血管及肺

4、泡上皮組織中Nogo-B的表達(dá)水平均較正常小鼠降低，以BALF細(xì)胞降低最為顯著，而B(niǎo)ALF中的細(xì)胞成分主要為AM。因此，我們推測(cè)Nogo-B對(duì)AM的功能發(fā)揮起著至關(guān)重要的作用。為了證實(shí)上述推論并初步闡明其分子機(jī)制，本研究選用小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7為研究對(duì)象，在LPS刺激下研究Nogo-B對(duì)巨噬細(xì)胞分泌、遷移、抗原提呈等免疫應(yīng)答過(guò)程的影響并初步探討其機(jī)制。
　　方法:
　　一、選擇小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7作為本實(shí)

5、驗(yàn)的研究對(duì)象，加入胎牛血清、青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37℃，5％ CO2濃度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。用Westernblot檢測(cè)巨噬細(xì)胞RAW264.7內(nèi)不同LPS濃度下以及LPS刺激后不同時(shí)間段內(nèi)Nogo-B表達(dá)水平。
　　二、分別采用腺病毒轉(zhuǎn)染和siRNA干擾的方法上調(diào)和下調(diào)巨噬細(xì)胞中Nogo-B的表達(dá)水平，選擇LPS刺激的最佳濃度和時(shí)長(zhǎng)，采用ELISA方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞炎癥因子的釋放情況，Transwell實(shí)驗(yàn)觀察巨噬細(xì)胞

6、的遷移能力的變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞表面MHCⅠ/Ⅱ進(jìn)而評(píng)估其抗原提呈能力，以及Western Blot方法檢測(cè)MSR1進(jìn)而判斷巨噬細(xì)胞的吞噬能力。
　　三、探索LPS刺激下Nogo-B影響巨噬細(xì)胞功能可能的機(jī)制。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同Nogo-B表達(dá)水平的巨噬細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)情況，Western Blot方法檢測(cè)不同Nogo-B表達(dá)水平的巨噬細(xì)胞中MAPK通路相關(guān)分子ERK、JNK和P38的磷酸化水平，以初步闡明Nog

7、o-B通過(guò)TLR4-MAPK通路調(diào)控巨噬細(xì)胞的生物學(xué)功能。
　　結(jié)果:
　　一、LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)Nogo-B的變化規(guī)律
　　巨噬細(xì)胞Nogo-B蛋白隨著LPS刺激濃度的增高而降低，即Nogo-B蛋白的表達(dá)水平呈現(xiàn)LPS濃度依賴(lài)性降低，在LPS濃度為1μg/ml時(shí)降至最低。當(dāng)LPS刺激濃度為1μg/ml時(shí)，巨噬細(xì)胞中Nogo-B的表達(dá)水平隨著LPS刺激時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降，在刺激后的24h其表達(dá)量降至最低并一直持續(xù)

8、到48h。
　　二、LPS刺激后，調(diào)控Nogo-B表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響
　　（一）、LPS刺激后，過(guò)表達(dá)Nogo-B的RAW264.7炎癥因子TNF-α，MCP-1和TGF-β的分泌均較對(duì)照組顯著增加;而低表達(dá)Nogo-B的RAW264.7炎癥因子TNF-α，IL-1β，MCP-1和TGF-β的分泌水平顯著受到抑制。
　　（二）、LPS刺激24h后，過(guò)表達(dá)Nogo-B的RAW264.7遷移能力較對(duì)照組升高1.8

9、倍;而低表達(dá)Nogo-B的RAW264.7則遷移能力較對(duì)照組減低1.5倍。
　　（三）、LPS刺激后MHCⅡ在過(guò)表達(dá)Nogo-B的RAW264.7中表達(dá)量隨著LPS刺激時(shí)間的推移顯著增加，而在低表達(dá)Nogo-B的RAW264.7中，MHCⅡ的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組。調(diào)控Nogo-B的表達(dá)水平，MHCⅠ的表達(dá)未見(jiàn)明顯變化。
　?。ㄋ模?、LPS刺激后24h，MSR1在過(guò)表達(dá)Nogo-B的RAW264.7中其表達(dá)量明顯升高，而在低表

10、達(dá)Nogo-B的RAW264.7中顯著減少。
　　三、Nogo-B影響巨噬細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)并調(diào)節(jié)MAPK通路的活化
　　LPS刺激后過(guò)表達(dá)Nogo-B的RAW264.7表面TLR4的平均熒光強(qiáng)度以及ERK，JNK和p38的磷酸化水平顯著升高，而低表達(dá)Nogo-B的RAW264.7其表達(dá)量顯著下降。
　　結(jié)論:
　　一、Nogo-B在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)水平受LPS刺激的影響，LPS濃度為1μg/ml刺激時(shí)間為2