脂質(zhì)體槲皮素誘導食管癌細胞逆轉(zhuǎn)化及可能機制的研究.pdf

1、背景：槲皮素(quercetin)是黃酮類化合物(flavanoid)的一個成員,化學名稱為3,3’,4’,5,7-五羥基黃酮(pentahydroxyflavone)。槲皮素在植物界分布廣泛,對正常細胞有抗氧化、清除體內(nèi)自由基、抗炎、抗過敏、抗菌、抗病毒,抑制惡性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移等多方面藥理作用,是近年來國內(nèi)外學者研究的熱門課題之一。由于槲皮素難溶于水,在體外研究可采用小于0.1％的二甲基亞砜(DMSO)作為溶劑,以終濃度為40μmol

2、/L的槲皮素溶液處理培養(yǎng)細胞,雖未對所培養(yǎng)的細胞產(chǎn)生不良效應,但考慮到DMSO不適于體內(nèi)應用的問題。為解決該問題,采用脂質(zhì)體(liposomal)包被藥物,以提高藥物的溶解性,并增加療效。食管鱗癌(esophageal squamous epithelial carcinoma,ESEC)是發(fā)生在食管鱗狀上皮組織的惡性腫瘤。我國是食管癌的高發(fā)國家之一。癌細胞的特征為具有抵抗低氧、化學藥物以及輻射等傷害而呈現(xiàn)失調(diào)的異常增殖能力,cycli

3、n D1高表達,與增殖密切相關(guān)的PI3k/Akt信號轉(zhuǎn)導途徑不能被失活的PTEN抑癌基因所抑制。食管癌細胞過高表達的c-met,VEGF惡性標志等為低氧條件下誘導形成的,調(diào)節(jié)氧化應激水平可提供針對抗癌細胞和癌干細胞治療的靶點。有報道指出,氧化應激(ROS)參與槲皮素誘導肝瘤細胞的凋亡。此外,槲皮素對非轉(zhuǎn)化的正常細胞具有抗氧化應激反應,不但不會如化療藥物那樣傷及正常細胞,而且尚具有防癌效應。因此槲皮素不但具有抗癌,而且具有防癌效應。本實驗

4、通過制備不同脂質(zhì)體槲皮素(liposomal quercetin,LQ),作用于Ecal09/9706細胞,應用光學顯微鏡進行形態(tài)學觀察,MTT實驗檢測其對細胞活性抑制的影響,檢測NO細胞化學活性和羥自由基水平,比較其對細胞氧化應激的作用[氧化應激包含反應氧族,ROS(O2.-,H2O2,·OH)和反應氮族,RNS(NO,ONOO-)兩者]。通過測定c-met,VEGF,cyclin D1和PTEN免疫組織化學反應和免疫印跡,探討其對癌

5、細胞惡性逆轉(zhuǎn)化的效應及可能機制。
　　目的：1.比較制備的不同脂質(zhì)體槲皮素對培養(yǎng)的食管癌細胞的生物學效應。2.觀察脂質(zhì)體槲皮素誘導人食管癌Ecal09/9706細胞的氧化應激反應和對癌細胞惡性逆轉(zhuǎn)化效應的影響,并探究兩者間的關(guān)聯(lián)機制。
　　方法：1.主要采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體槲皮素,制備按一定比例的氯仿和甲醇溶解類脂物質(zhì)的脂質(zhì)體槲皮素LQ1,制備按同比例的氯仿和DMSO作為溶劑的脂質(zhì)體槲皮素LQ2。油紅-O染色觀察所制備的

6、脂質(zhì)體槲皮素的形態(tài)。用DMSO直接溶解槲皮素,制備非脂質(zhì)體槲皮素(non-liposomal quercetin,nLQ)。2.MTT實驗檢測脂質(zhì)體槲皮素對Ecal09/9706細胞活性的抑制率,實驗分為四組:LQ1組、LQ2組、nLQ組、對照組。3.脂質(zhì)體槲皮素處理48h后的Ecal09/9706細胞,檢測NO細胞化學活性和用試劑盒檢測羥自由基水平。4.免疫組織化學染色檢測PTEN,c-met,VEGF和cyclin D1,在脂質(zhì)體槲

7、皮素處理48h后Ecal09/9706細胞中表達及定位的改變。5.脂質(zhì)體槲皮素處理48h后的Ecal09/9706細胞,以Trizol試劑提取其總蛋白質(zhì),檢測蛋白質(zhì)濃度后進行SDS-PAGE電泳。6.將SDS-PAGE電泳膠轉(zhuǎn)膜于硝酸纖維素膜(NCM)上,對c-met,VEGF,cyclinD1和PTEN(以β-actin作為內(nèi)參照)進行免疫印跡定性及半定量。7.統(tǒng)計分析采用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計分析,服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)變量數(shù)據(jù)以

8、均數(shù)±標準差((?)±s)表示,不同處理組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析,指標間的相關(guān)性采用二元變量的相關(guān)分析。結(jié)果判斷以α=0.05為顯著性水準。
　　結(jié)果：1.在脂質(zhì)體槲皮素的溶解度和均勻性方面:LQ2組優(yōu)于LQ1組。在油鏡下可見LQ2組的微粒呈均勻分布,紅色類脂物質(zhì)包圍著一個中心微粒的槲皮素。2.MTT檢測結(jié)果表明Eca-109和Eca-9706的細胞活性抑制率(suppressing rate,SR)依次為LQ2組>LQ1

9、組>nLQ組>對照組,P<0.05。3.NO細胞化學活性呈藍色細顆粒分布于胞質(zhì)內(nèi),尤其周緣胞質(zhì)更明顯,其活性從高至低依次為:LQ2組>LQ1組>nLQ組>對照組,P<0.05。4.羥自由基檢測的數(shù)值由高至低排列為:LQ2組>LQ1組>nLQ組>對照組,P<0.05,四組NO細胞化學活性與羥自由基檢測的數(shù)值之間呈顯著正相關(guān),r109=0.956,P<0.05,r9706=0.957,P<0.05。5.在人食管癌Eca-109及-9706的

10、對照組細胞中c-met,VEGF,PTEN及cyclinD1的免疫反應性(immunoreactivity,IR)呈棕色細顆粒。cyclin D1-IR及PTEN-IR主要分布于胞核,c-met-IR及VEGF-IR分布于胞質(zhì)/胞核。c-met及VEGF及cyclin D1的圖像掃描灰度均值從高至低為:對照組>nLQ組>LQ1組>LQ2組,P<0.05。PTEN的圖像掃描灰度均值正好相反,從高至低為:LQ2組>LQ1組>nLQ組>對照組

11、,P<0.05。6.c-met,VEGF,cyclin D1及β-actin的免疫印跡主帶分別為c-met,145 kDa;cyclin D1,36kDa;VEGF,21kDa和β-actin,42kDa。各印跡信號的數(shù)值為各主帶掃描灰度均值與各β-actin掃描灰度均值的比值,從高至低依次為:對照組>nLQ組>LQ1組>LQ2組,P<0.05。人食管癌Eca-109/9706細胞的PTEN免疫印跡信號掃描灰度均值低下,且呈現(xiàn)>55kD

12、a的一些突變細條帶;各組免疫印跡信號由高至低為:LQ2組>LQ1組>nLQ組>對照組,P<0.05。四組免疫印跡信號與免疫組化反應性呈正相關(guān),r=0.89~0.95,P<0.05。
　　結(jié)論：1.按一定比例的氯仿和DMSO溶解類脂物質(zhì)制備的脂質(zhì)體槲皮素的溶解性、均勻性及藥效性比按同比例的氯仿和甲醇作為溶劑制備的生物學效應為好。2.LQ2對Ecal09/9706細胞活性抑制率高于LQ1組。3.脂質(zhì)體槲皮素處理Ecal09/9706細