暗色透明帶卵母細(xì)胞的IVF臨床妊娠結(jié)局及相關(guān)機制的研究.pdf

1、研究背景:
　　卵母細(xì)胞形態(tài)學(xué)評分,是通過光鏡下觀察卵母細(xì)胞的形態(tài)并沒有損害卵母細(xì)胞和胚胎的生物活性,不會影響其發(fā)育潛能,故很適合應(yīng)用于輔助生殖等生物技術(shù)領(lǐng)域。透明帶也是我們?nèi)粘Ｔu價胚胎和卵母細(xì)胞質(zhì)量和發(fā)育潛能的指標(biāo)之一。已有研究報道,透明帶蛋白組成、厚度、顏色或者形態(tài)異常均可以影響受精、胚胎發(fā)育潛能和種植率。暗色透明帶在透明帶異常中發(fā)生率較高,且受精率和胚胎發(fā)育潛能低下。為了更進(jìn)一步了解暗色透明帶的患者IVF-ET結(jié)局的差異,本

2、研究從另一角度即卵子本身的質(zhì)量來探究這一問題。
　　研究目的:
　　分析暗色透明帶(Dark Zona Pellucida,DZP)卵母細(xì)胞來源的胚胎對妊娠結(jié)局的影響,并從細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)和分子水平去深入研究DZP卵母細(xì)胞質(zhì)量下降、受精率低及胚胎發(fā)育潛能差的原因。為分析和評估卵母細(xì)胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育潛能,提供了新的標(biāo)準(zhǔn)和理論依據(jù)。
　　研究對象和方法:
　　1.收集安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院生殖中心2010年11月~2

3、012年6月共268名接受IVF或ICSI治療的不孕癥患者。在一次促排周期中出現(xiàn)DZP卵子的患者為研究組,其中研究組A共47例(33例IVF,14 ICSI周期),為取出的卵母細(xì)胞中部分卵母細(xì)胞的透明帶正常,部分卵母細(xì)胞為 DZP的患者,研究組 B共22例(8例IVF,14 ICSI周期),為全部卵母細(xì)胞均是DZP的患者;同期全部卵母細(xì)胞帶正常透明帶(Zona Pellucida,ZP)的患者206例(143例IVF,63ICSI周期)

4、的為對照組。三組患者的年齡均小于等于36歲,不孕原因均為輸卵管因素和/或男方因素(弱精子癥、梗阻性無精子癥等)等,并排除染色體異常、卵巢低反應(yīng)等疾病。比較三組間的患者一般情況及妊娠結(jié)局。統(tǒng)計學(xué)方法采用單因素ANOVA檢驗和χ2檢驗。
　　2.收集我院生殖中心行 IVF-ET新鮮周期未受精的卵母細(xì)胞共23枚,其中帶有DZP卵母細(xì)胞11枚,正常卵母細(xì)胞12枚。在透射電子顯微鏡下觀察暗色透明帶的卵母細(xì)胞和正常卵母細(xì)胞,對透明帶,卵母細(xì)胞

5、卵周隙,卵母細(xì)胞細(xì)胞器等超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。
　　3.分別收集DZP卵母細(xì)胞和正常卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞,利用實時定量熒光PCR和Western-Blot對顆粒細(xì)胞中Cx43、Cx37 mRNA和Cx43、Cx37蛋白的表達(dá)量進(jìn)行測定。
　　結(jié)果:
　　1.三組患者的IVF臨床數(shù)據(jù):三組患者年齡,不孕年限,基礎(chǔ)激素,卵巢刺激用藥天數(shù),Gn用藥總量,注射HCG日內(nèi)膜厚度及E2值和移植周期數(shù)間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。研究組 A與正常

6、對照組在受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和妊娠結(jié)局上并未見明顯差異。而研究組B的2PN受精率(59.4％vs.76.3,IVF受精;67.7%vs.82.3%,ICSI受精)、優(yōu)質(zhì)胚胎率(51.7%vs.66.0%)、胚胎種植率(18.6 vs.34.5%)、臨床妊娠率(25.0%vs.53.3%)均明顯低于對照組,差異顯著(P<0.05)。
　　2.透射顯微鏡下觀察DZP卵母細(xì)胞和正常組卵母細(xì)胞發(fā)現(xiàn)卵周隙,細(xì)胞胞質(zhì)中皮質(zhì)顆粒、高爾基體,粗面內(nèi)

7、質(zhì)網(wǎng)和核糖體等細(xì)胞器與對照組相比未發(fā)現(xiàn)明顯異常。但DZP卵母細(xì)胞中ZP內(nèi)電子致密物明顯增多,胞質(zhì)中異常線粒體比例增高、液泡明顯增多。
　　3.利用熒光定量PCR擴增檢測Cx43、Cx37 mRNA在顆粒細(xì)胞中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)在DZP卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞中表達(dá)水平顯著低于正常組(P<0.05)。選取DZP顆粒細(xì)胞及正常顆粒細(xì)胞,利用Western blot法檢測細(xì)胞中Cx43、Cx37蛋白含量。結(jié)果顯示,DZP卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞中Cx43

8、、Cx37蛋白表達(dá)水平明顯降低。
　　結(jié)論:
　　研究組B的2PN受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率和臨床妊娠率較正常對照組均顯著降低,有統(tǒng)計學(xué)差異。另外透射電鏡結(jié)果顯示DZP卵母細(xì)胞ZP內(nèi)電子致密物增多、胞質(zhì)中線粒體受損,液泡明顯增多;DZP卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞中Cx43、Cx37 mRNA和蛋白表達(dá)量明顯降低。這些結(jié)果表明DZP卵母細(xì)胞中可能存在胞質(zhì)發(fā)育不成熟,卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞間隙連接受損,從而導(dǎo)致DZP卵母細(xì)胞質(zhì)量下降、胚胎發(fā)